牛秋雪 邵仙萍* 叶金云* 戚常乐 吴成龙 庞 栋 董舒乐 莫俊燕

(1.湖州师范学院生命科学学院,水生动物繁育与营养国家地方联合工程实验室,浙江省水生生物资源养护与开发技术研究重点实验室,湖州 313000;2.湖州学院生命健康学院,湖州 313000)

鱼粉富含蛋白质,氨基酸组成均衡,适口性好,可被水产动物较好的吸收利用,一直是水产动物饲料中蛋白质的主要来源[1]。近年来,鱼粉的需求持续增加,但由于气候和环境因素,海洋渔业资源暴跌,导致鱼粉产量急剧下降,供不应求,鱼粉价格居高不下[2]。随着水产养殖业的发展,我国对鱼粉的需求量越来越高,国产鱼粉的产量又满足不了国内的市场需求,鱼粉长期依赖进口,这种情况严重增加了养殖成本,降低了经济效益,阻碍了我国水产养殖业的可持续发展,因此,寻找合适的蛋白质源替代鱼粉迫在眉睫。

水产养殖的进一步增长取决于开发可持续的蛋白质来源,以取代水产动物饲料中的鱼粉。昆虫种类和数量繁多,繁殖周期短,生长快且成本低廉,对环境影响小,已受到研究者们的广泛关注[3-4]。黑水虻(Hermetiaillucens)学名亮斑扁角水虻,是腐生性昆虫,隶属双翅目,水虻科,扁角水虻属。黑水虻幼虫具有蛋白质含量高,氨基酸组成均衡,富含抗菌肽、几丁质等特性。因此,黑水虻幼虫可以作为替代饲料中鱼粉的优质蛋白质原料,在水产动物饲料行业具有广阔的应用前景[5]。黑水虻幼虫粉作为一种潜在的高质量蛋白质来源,已有学者在大口黑鲈(Micropterussalmoides)[6-8]、拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)[9]、乌鳢(Channaargus)[10]、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[11]、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)[12]、半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)[13]、大黄鱼(Larimichthyscrocea)[14]、建鲤(Cyprinuscarpiovar. Jian)[15]等水产动物中进行了研究,并获得了良好的研究效果。Li等[13]用脱脂黑水虻幼虫粉替代饲料中的鱼粉饲养半滑舌鳎,发现25%替代组的生长性能和饲料利用率最好。韩星星[14]在对大黄鱼进行研究时发现,饲喂用40%的脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉的饲料,对大黄鱼幼鱼的生长性能、体成分不会产生负面影响。Li等[15]用脱脂黑水虻虫粉替代鱼粉饲养建鲤,结果发现可替代50%的鱼粉。Wang等[16]发现,60%的黑水虻幼虫粉替代鱼粉不会对凡纳滨对虾的生长、机体免疫和抗氧化能力造成负面影响,超过60%的替代比例则会对肝脏组织结构造成不利影响。

中华鳖(Pelodiscussinensis)又称甲鱼、元鱼等,属于卵生两栖爬行类动物,是我国著名且重要的水产养殖动物。中华鳖富含蛋白质、脂肪、多糖及多种微量元素与维生素,具有较高的营养价值和药用价值,是一种传统的滋补佳品,广泛受到人们的喜爱[17]。中华鳖生活于淡水水域,是以肉食性为主的杂食性动物,对蛋白质的需求量非常高,饲料配方中鱼粉的占比较大,但是近年来鱼粉产量供不应求,价格居高不下,所以目前对中华鳖饲料中鱼粉替代蛋白质源方面的研究比较多,如使用发酵豆粕[18]、棉粕酶解蛋白[19]、蚕蛹粉[20]、蝇蛆蛋白[21]、大豆浓缩蛋白[22]、大米酶解蛋白[23]等替代饲料中不同比例的鱼粉。虽然已经有很多专家学者对黑水虻虫粉替代鱼粉开展了研究,但是大多集中在鱼类和甲壳类动物上,在两栖爬行类动物上的研究成果较少。为此,本试验以脱脂黑水虻幼虫粉替代饲料中不同水平的鱼粉,研究其对中华鳖稚鳖生长性能、抗氧化能力以及肝脏和肠道健康的影响,以期为黑水虻虫粉在中华鳖饲料中的应用提供参考依据,为中华鳖规模化的健康养殖提供保障。

1 材料与方法

1.1 试验饲料的制作

以白鱼粉(粗蛋白质含量为67.68%,粗脂肪含量为6.54%)、脱脂黑水虻幼虫粉(粗蛋白质含量为46.71%,粗脂肪含量为13.72%)、豆粕、玉米蛋白粉和血粉为蛋白质源,α-淀粉为糖源,鱼油为脂肪源,配制成5种等氮等脂的试验饲料。5种试验饲料中脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉的比例分别为0(F0)、15%(F15)、30%(F30)、45%(F45)、60%(F60)。试验饲料的各种原料经粉碎机粉碎后过60目筛称重,通过逐级扩大法将各种原料混匀,充分混匀后将混合物用双螺杆挤条机制成直径为1.5 mm的颗粒饲料,然后放到热风循环烘箱内37 ℃烘至恒重,最后密封好放到-20 ℃冰箱内保存备用。试验饲料组成及营养水平见表1,白鱼粉、脱脂黑水虻幼虫粉以及试验饲料的氨基酸组成见表2。

表1 试验饲料组成及营养水平(风干基础)

续表1项目 Items试验饲料 Experimental dietsF0F15F30F45F60鱼油 Fish oil4.303.222.161.08酵母水解物 Yeast hydrolysate1.501.501.501.501.50维生素预混料 Vitamin premix1)0.600.600.600.600.60矿物元素预混料 Mineral premix2)0.600.600.600.600.60磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)21.801.801.801.801.80氯化胆碱 Choline chloride0.500.500.500.500.50合计 Total100.00100.00100.00100.00100.00营养水平(实测值) Nutrient levels (measured values)干物质 DM91.9792.8993.0093.4293.45粗蛋白质 CP45.5345.7245.6545.4045.50粗脂肪 EE7.127.207.167.407.41粗灰分 Ash10.6511.3812.2012.7213.24

表2 白鱼粉、脱脂黑水虻幼虫粉以及试验饲料的氨基酸组成(风干基础)

续表2项目Items白鱼粉White fish meal脱脂黑水虻幼虫粉Defatted black soldier fly larvae meal试验饲料 Experimental dietsF0F15F30F45F60半胱氨酸 Cys0.69±0.020.39±0.010.49±0.010.47±0.010.47±0.010.45±0.010.42±0.01酪氨酸 Tyr2.19±0.052.80±0.041.39±0.011.51±0.011.62±0.021.79±0.011.96±0.06脯氨酸 Pro6.59±0.125.13±0.065.40±0.015.22±0.035.24±0.065.08±0.015.09±0.11总非必需氨基酸 TNEAA36.20±0.8226.10±0.5125.28±0.0625.00±0.0924.86±0.2024.90±0.1225.15±0.70总氨基酸 TAA66.40±1.5545.64±0.7845.01±0.1644.54±0.1844.01±0.3644.15±0.2044.51±0.32

1.2 试验动物与饲养管理

试验用中华鳖稚鳖购自浙江湖州菱湖养殖场,在湖州师范学院水生生物养殖系统进行养殖。中华鳖稚鳖在规格为50 cm×60 cm×40 cm的玻璃缸内养殖,缸内设有增氧装置,一共25个玻璃缸。在每个玻璃缸内都采用聚氯乙烯(PVC)扁管及网片作为水中的遮蔽物,水面上设置漂浮木板作为中华鳖稚鳖休息与晒背场所。选取规格相近、体表无伤、体质健壮的中华鳖稚鳖175只,初重为(4.98±0.18) g,在经过低浓度的碘消毒后,随机分成5组,每组设置5个重复,每个重复7只中华鳖,分别饲喂5种等氮等脂的试验饲料,养殖周期为8周。在饲养过程中,每日投喂量为每缸中华鳖体重的3%～5%,每日投喂3次(08:00、12:30、17:30),每周根据中华鳖稚鳖生长情况调整投喂量。正式养殖试验开始前先暂养1周。试验期间,水温保持在28～32 ℃,每天保持不间断地充气增氧和吸污,每次吸污之后再进行饲料投喂;每天换水,每次的换水量大约为总水量的1/3;光照与自然光照同步。试验期间记录水温、投喂量、摄食和死亡情况。

1.3 样品采集与指标测定

1.3.1 样品采集

饲养8周后,禁食24 h,用MS-222将中华鳖稚鳖麻醉,用毛巾擦干体表的水分,记录每组中华鳖数目并称重,测量体长、体厚、体宽。从每个玻璃缸中随机选取1只中华鳖进行体成分分析,余下的中华鳖稚鳖进行试验样品的采集。使用1 mL注射器,从中华鳖稚鳖的脖颈血管处抽血,将血液放入1.5 mL离心管中,在4 ℃条件下3 500 r/min离心10 min,吸取上清液,然后将血清样品放在-80 ℃的冰箱内保存备用。随后将中华鳖稚鳖于冰袋上解剖,采集肝脏和肠道,剥离四肢附着的脂肪组织,测量肝脏湿重和四肢脂肪湿重并记录,另取部分肠道组织置于组织固定液中,用于制作组织切片。

1.3.2 生长性能与形体指标的测定

根据以下公式计算相关指标:

成活率(survival rate,SR,%)=
(终末只数/初始只数)×100;
增重率(weight gain rate,WGR,%)=
[(终末体重-初始体重)/初始体重]×100;
饲料系数(feed conversion ratio,FCR)=
摄食量/(终末体重-初始体重);
特定生长率(specific growth rate,SGR,%/d)=
[(ln终末体重-ln初始体重)/养殖天数]×100;
体比系数(body coefficient,BC,%)=
(体厚/体宽)×100;
肝体指数(hepatosomatic index,HSI,%)=
(肝脏湿重/终末体重)×100;
脂体指数(intraperitoneal index,IPI,%)=
(四肢脂肪湿重/终末体重)×100。

1.3.3 试验饲料和中华鳖体常规营养成分分析

试验饲料和中华鳖体的常规营养成分含量检测方法如下:按照(105±2) ℃烘箱烘至恒重的方法直接测定水分含量,然后计算干物质含量;使用杜马斯全自动快速定氮仪测定粗蛋白质含量;按照索氏抽提法测定粗脂肪含量;使用马弗炉于550 ℃灼烧法测定粗灰分含量;使用全自动氨基酸分析仪(日立L-8900)测定氨基酸(除色氨酸)含量。

1.3.4 血清生化指标、肝脏抗氧化指标以及肝脏和肠道消化酶活性的测定

血清生化指标:总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、乳酸(LD)含量,谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)活性,ALB/GLB、GOT/GPT比值。

肝脏抗氧化指标:丙二醛(MDA)含量,过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性,总抗氧化能力(T-AOC)。

肝脏和肠道消化酶活性:胰蛋白酶(TRY)、α-淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)活性。

以上指标均采用南京建成生物技术研究所生产的试剂盒进行测定,测定方法参照说明书进行。

1.3.5 肠道组织形态和肠道菌群的测定

将刚分离的肠道组织在4 ℃环境下固定于4%多聚甲醛内,送至杭州浩克生物技术有限公司进行石蜡包埋制作切片,苏木精-伊红(HE)染色后用KF-Viewer软件观察形态结构并测量绒毛高度(VH)、黏膜厚度(MT)、隐窝深度(CD)。取肠道组织送至广州基迪奥生物科技有限公司,进行16S rRNA高通量测序,然后对中华鳖稚鳖的肠道菌群进行分析。

1.4 数据统计与分析

试验数据用统计学方法进行处理。用SPSS 25.0软件对试验数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA),如果差异显著,再用Duncan氏法进行多重比较,以P<0.05为差异显著标准,试验结果采用平均值±标准误(mean±SE)表示。

2 结 果

2.1 脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖生长性能与形体指标的影响

脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖生长性能与形体指标的影响如表3所示。各组中华鳖稚鳖的摄食量、体比系数和肝体指数没有显著差异(P>0.05)。与对照组(F0组)相比,F15、F30和F45组的终末体重、成活率、增重率和特定生长率均没有发生显著变化(P>0.05),F60组则显著降低(P<0.05);F15和F45组的饲料系数没有显著变化(P>0.05),F30和F60组则显著升高(P<0.05)。中华鳖稚鳖的脂体指数随着替代比例的上升呈现先升高后降低的变化趋势,当脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉比例为45%和60%时,与对照组相比显著降低(P<0.05)。

表3 脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖生长性能与形体指标的影响

2.2 脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖体成分的影响

脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖体成分的影响如表4所示。脱脂黑水虻幼虫粉替代不同比例的鱼粉使中华鳖稚鳖的干物质、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量不同程度降低。F60组的干物质、粗脂肪、粗蛋白质和粗灰分含量均显著低于对照组(P<0.05),F30组的粗脂肪和粗蛋白质含量与对照组没有显著差异(P>0.05)。

表4 脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖体成分的影响

2.3 脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖血清生化指标的影响

脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖血清生化指标的影响如表5所示。各组中华鳖稚鳖血清中TP、ALB、GLB和LD含量,ALB/GLB和GOT/GPT比值,GPT、GOT和AKP活性均无显著差异(P>0.05)。F45组血清中ACP活性显著高于对照组(P<0.05),但是其他组与对照组差异不显著(P>0.05)。

表5 脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖血清生化指标的影响

2.4 脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖肝脏抗氧化指标的影响

脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖肝脏抗氧化指标的影响如表6所示。随着替代比例的上升,中华鳖稚鳖肝脏MDA含量逐渐降低,4个替代组(F15、F30、F45和F60组)均显著低于对照组(P<0.05)。4个替代组的肝脏T-AOC与对照组没有显著差异(P>0.05)。肝脏CAT和SOD活性随着替代比例的上升呈现先升高后降低的趋势,虽然在各组之间没有显著差异(P>0.05),但是4个替代组的肝脏CAT和SOD活性均高于对照组。F30组肝脏T-AOC、CAT和SOD活性最高。

表6 脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖肝脏抗氧化指标的影响

2.5 脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖肝脏和肠道消化酶活性以及肠道组织形态的影响

脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖肝脏和肠道消化酶活性的影响如表7所示。随着替代比例的上升,中华鳖稚鳖肝脏胰蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶活性有先上升后下降的趋势,均在F30组达到最高。与对照组相比,各替代组肝脏胰蛋白酶和α-淀粉酶活性没有显著变化(P>0.05),但F30组肝脏α-淀粉酶活性显著高于F45和F60组(P<0.05);F30组肝脏脂肪酶活性较对照组显著升高(P<0.05)。肠道胰蛋白酶活性在各组之间没有显著差异(P>0.05);当脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉比例为45%时,肠道的α-淀粉酶和脂肪酶活性最高,其中α-淀粉酶显著高于F15组(P<0.05),脂肪酶活性显著高于F30组(P<0.05)。

表7 脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖肝脏和肠道消化酶活性的影响

中华鳖稚鳖肠道组织切片见图1,脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖肠道形态的影响如表8所示。中华鳖稚鳖肠道的隐窝深度在各组之间没有显著差异(P>0.05),但是当脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉比例为45%时,肠道的绒毛高度和黏膜厚度是最大的,而隐窝深度是最小的。F45组肠道的绒毛高度显著高于对照组(P<0.05),黏膜厚度显著高于F15组(P<0.05)。各替代组肠道的黏膜厚度与对照组相比没有显著变化(P>0.05)。

2.6 脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖肠道菌群的影响

脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖肠道菌群alpha多样性的影响如表9所示。所有样品的覆盖率(Goods coverage)均在99.96%以上,证明本次样品中存在的微生物种类在测序过程中均被检测到。与对照组相比,脱脂黑水虻幼虫粉替代不同比例鱼粉对中华鳖稚鳖肠道菌群alpha多样性指数(Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数、ACE指数)没有显著影响(P>0.05)。

VH:绒毛高度 villus height;CD:隐窝深度 crypt depth;MT:黏膜厚度 mucosa thickness。

表8 脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖肠道组织形态的影响

表9 脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖肠道菌群alpha多样性的影响

图2为各组中华鳖稚鳖肠道菌群在门和属水平上的组成。在门水平上,5组中华鳖稚鳖肠道菌群中排在前10的菌门为变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、埃普西隆杆菌门(Epsilonbacteraeota)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、衣原体门(Chlamydiae)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)。虽然各组替代鱼粉的比例不同,但是各组肠道菌群在相对丰度排在前3的优势菌门是相同的,均是变形菌门、梭杆菌门、厚壁菌门,其中相对丰度最高的优势菌门是变形菌门,在F0～F60组中的相对丰度分别为59.79%、73.97%、64.22%、83.52%、61.32%。在属水平上,5组中华鳖稚鳖肠道菌群中排在前10的菌属为邻单胞菌属(Plesiomonas)、鲸杆菌属(Cetobacteriu)、不动杆菌属(Acinetobacter)、弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、副梭菌属(Paraclostridium)、拟杆菌属(Bacteroides)、螺杆菌属(Helicobacter)、阿克曼菌属(Akkermansia)。5组中华鳖稚鳖肠道菌群中相对丰度最高的优势菌属是不相同的,F0组是鲸杆菌属,占比32.31%,F15组是邻单胞菌属,占比55.28%,F30组是鲸杆菌属,占比22.73%,F45组是邻单胞菌属,占比33.78%,F60组是邻单胞菌属,占比31.68%,其中F0和F30组的优势菌属相同,F15、F45和F60组的优势菌属相同。

Proteobacteria:变形菌门;Fusobacteria:梭杆菌门;Firmicutes:厚壁菌门;Bacteroidetes:拟杆菌门;Epsilonbacteraeota:埃普西隆杆菌门;Verrucomicrobia:疣微菌门;Chlamydiae:衣原体门;Actinobacteria:放线菌门;Chloroflexi:绿弯菌门;Planctomycetes:浮霉菌门;Plesiomonas:邻单胞菌属;Cetobacteriu:鲸杆菌属;Acinetobacter:不动杆菌属;Vibrio:弧菌属;Aeromonas:气单胞菌属;Bacillus:芽孢杆菌属;Paraclostridium:副梭菌属;Bacteroides:拟杆菌属;Helicobacter:螺杆菌属;Akkermansia:阿克曼菌属;Other:其他;Unclassified:未分类。

分别对中华鳖稚鳖肠道中主要菌群在门、属和种水平上的相对丰度进行单因素方差分析,数据整理后得到表10。由表10可知,各组中华鳖稚鳖肠道菌群的相对丰度在门水平上无显著差异(P>0.05);脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉后变形菌门和厚壁菌门的相对丰度有升高的趋势,梭杆菌门和拟杆菌门的相对丰度有降低的趋势。在属水平上,F15组邻单胞菌属的相对丰度显著高于F0和F30组(P<0.05),与F45和F60组无显著差异(P>0.05);脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉后鲸杆菌属和气单胞菌属的相对丰度有降低的趋势,不动杆菌属和弧菌属的相对丰度有升高的趋势,但是变化均不显著(P>0.05)。在种水平上,F15组类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)的相对丰度显著高于F0和F30组(P<0.05),与F45和F60组无显著差异(P>0.05);霍乱弧菌(Vibriocholerae)和维氏气单胞菌(Aeromonasveronir)的相对丰度各组间无显著差异(P>0.05)。

表10 脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖肠道主要菌群相对丰度的影响

脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖肠道梭杆菌门/变形菌门比值和稳态指数[(梭杆菌门+厚壁菌门+拟杆菌门)/变形菌门]的影响如图3所示。从图中可以看出,各替代组肠道梭杆菌门/变形菌门比值和稳态指数都低于对照组,但是差异均不显著(P>0.05),且各替代组间也没有显著差异(P>0.05)。

3 讨 论

3.1 脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖生长性能、形体指标和体成分的影响

本试验结果表明,随着脱脂黑水虻幼虫粉替代饲料中鱼粉比例的上升,中华鳖稚鳖的摄食量、体比系数和肝体指数均没有发生显著变化,且替代比例为45%时对中华鳖稚鳖的增重率、成活率、特定生长率、饲料系数也没有产生显著影响,但替代比例为60%时,增重率、特定生长率、成活率和脂体指数显著降低,饲料系数显著升高,这说明饲料中适量添加脱脂黑水虻幼虫粉不会影响中华鳖的生长。韩星星[14]利用脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉饲喂大黄鱼幼鱼的研究发现,40%的替代比例能够显著提高大黄鱼幼鱼的增重率和特定生长率,但是替代比例超过40%会影响大黄鱼幼鱼的生长。在遗传背景与试验环境一致的情况下,中华鳖稚鳖的生长主要受摄食情况和饲料营养成分的影响。黑水虻幼虫含有几丁质成分,几丁质能够抑制机体对营养物质的吸收,从而降低生长性能[24]。因此,本研究中,当脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉比例达到60%时会降低中华鳖稚鳖的生长,其原因可能与饲料中几丁质含量升高有关。

数据柱未标注字母表示差异不显著(P>0.05)。

体成分是评价鱼类生长和营养状况的重要指标。本试验结果表明,脱脂黑水虻幼虫粉替代饲料中不同比例的鱼粉使中华鳖稚鳖的干物质、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量不同程度降低。在大口黑鲈中也发现了类似的结果,即脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉影响了蛋白质和脂肪在大口黑鲈体内的沉积,降低了大口黑鲈全鱼粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分的含量[25]。Wang等[26]对七星鲈(Lateolabraxjaponicus)的研究结果显示,随着脱脂黑水虻幼虫粉替代比例的上升,全鱼粗蛋白质和粗灰分含量逐渐降低,其中48%替代组与对照组差异显著。Xiao等[11]的试验结果也表明,随着脱脂黑水虻粉添加量的增加,黄颡鱼全鱼粗蛋白质和粗脂肪含量逐渐下降。但是对建鲤的研究则显示,脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉不会影响鱼体蛋白质的沉积[15]。出现上述不同研究结果可能与饲料配方组成不同以及饲粮中脱脂黑水虻幼虫粉的添加量不同有关。

3.2 脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖血清生化指标的影响

鱼类的血清生化指标与其营养状态和代谢状况有着密切的联系,同时也是评价健康状况和应激状况的关键指标[27]。血清中GPT和GOT的活性是反映动物肝细胞受损伤的主要标志[28-29]。一般而言,这2种转氨酶在机体肝脏中的活性最高,在血清中的活性偏低,但是当肝细胞受到损伤时,血液中GOT和GPT的活性就会增强[30]。ACP和AKP在水产动物非特异性免疫过程中发挥着重要作用,血清中ACP和AKP的活性可反映动物机体的免疫功能[31]。本研究中,随着脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉比例的增加,血清中GPT、GOT和AKP的活性无显著变化,ACP活性有所升高,45%替代组的ACP活性与对照组相比有显著差异,这表明45%的替代比例会提高中华鳖稚鳖的非特异性免疫能力。当血清中ALB含量下降、GLB含量上升,即ALB/GLB比值下降,会造成机体免疫紊乱[32]。本试验中,脱脂虫粉替代不同比例鱼粉对中华鳖稚鳖血清ALB、GLB、TP含量及ALB/GLB比值没有显著影响,说明脱脂虫粉代替部分鱼粉后未造成中华鳖稚鳖免疫紊乱,这与脱脂黑水虻虫粉替代鱼粉在黄颡鱼[33]和建鲤[15]上所得的结果一致。

3.3 脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖肝脏抗氧化能力的影响

T-AOC是反映机体内各种抗氧化酶的总活性,具有清除活性氧、判断机体健康状况的重要作用;CAT和SOD可以有效地清除氧自由基,保护机体免受氧化损伤[14]。MDA是一种重要的膜脂质过氧化产物,可间接反映机体受损伤程度,其含量越高损伤程度越大[34]。因此,T-AOC、SOD与CAT活性以及MDA含量是检测机体抗氧化能力的重要指标。本研究显示,随着脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉比例的上升,中华鳖稚鳖肝脏CAT和SOD活性呈现先升高后降低的趋势,但各组之间没有显著差异;肝脏MDA含量逐渐降低,4个替代组均显著低于对照组;4个替代组肝脏T-AOC与对照组没有显著差异,以30%替代组肝脏T-AOC最高。陈永康等[35]对凡纳滨对虾的研究发现,随着黑水虻幼虫粉替代鱼粉比例的上升,肝胰腺T-AOC和SOD活性先升高后降低,替代比例为20%时抗氧化能力最高。在对大黄鱼幼鱼的研究中,随着脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉比例的上升,肝脏T-AOC和CAT活性先上升后降低,肝脏MDA含量下降,替代比例为40%时抗氧化酶活性最高[14]。上述研究结果与本试验研究结果一致,说明脱脂黑水虻幼虫粉替代饲料中部分鱼粉可以提高中华鳖稚鳖肝脏抗氧化能力。

3.4 脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖肝脏和肠道消化酶活性以及肠道组织形态的影响

肝脏和肠道是机体消化吸收营养物质的重要器官,完整的肠道形态结构是水产动物健康生长的基础[26]。Lu等[36]研究发现,提高饲料中脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉的比例会降低草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肠道胰蛋白酶和脂肪酶活性。Li等[13]对半滑舌鳎的研究也有相似的结果,即脱脂黑水虻幼虫粉替代超过25%的鱼粉会降低肠道胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性。本试验中,随着脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉比例的上升,中华鳖稚鳖肝脏胰蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶活性均有先上升后下降的趋势,在F30组达到最高;肠道胰蛋白酶活性在各组之间没有显著差异;肠道α-淀粉酶和脂肪酶活性以及绒毛高度和黏膜厚度在45%替代组最高。在本试验条件下,脱脂黑水虻幼虫粉替代60%的鱼粉对中华鳖稚鳖肠道组织结构没有造成损伤。但是,Li等[15]报道,当建鲤饲料中黑水虻幼虫粉替代鱼粉的比例超过75%时会对肠道造成损伤,其肠道炎症可能与饲料中几丁质含量有关[37]。上述研究结果表明,脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉的比例过高会导致鱼体肠道功能受损,所以要注意脱脂黑水虻幼虫粉在饲料中的添加量。

3.5 脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对中华鳖稚鳖肠道菌群的影响

水产动物肠道中有丰富而复杂的微生物群落,肠道菌群对肠道发育、抵御病原微生物入侵至关重要,同时还参与机体营养代谢,在机体免疫调节等方面发挥作用[38-39]。因此,健康的肠道菌群对水产动物生长至关重要。有研究发现,饲料中添加脱脂黑水虻幼虫粉会增加虹鳟肠道菌群多样性[40]。但是,Lu等[36]的研究发现,脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对草鱼幼鱼肠道菌群多样性没有显著影响。陈延娜等[41]研究表明,饲料中添加黑水虻虫油能够改变草鱼肠道菌群组成,随着黑水虻虫油添加量的提高,草鱼肠道菌群的丰度和多样性也会提高。本试验结果发现,脱脂黑水虻幼虫粉替代不同比例的鱼粉对中华鳖稚鳖肠道菌群多样性没有显著影响,但是对不同菌群的相对丰度有一些改变。有研究发现,稳态指数与鱼体健康有关,梭杆菌门/变形菌门比值越高,肠道微生物群落越稳定[42-43]。本试验结果发现,脱脂黑水虻幼虫粉替代不同比例的鱼粉对中华鳖稚鳖肠道梭杆菌门/变形菌门比值和稳态指数没有显著影响。邻单胞菌属和气单胞菌属属于有害菌属,鲸杆菌属属于有益菌属[44-45]。本研究中,30%替代组邻单胞菌属的相对丰度最低,鲸杆菌属的相对丰度较高;随着替代比例的上升,霍乱弧菌和维氏气单胞菌的相对丰度有先降低后升高的趋势,以30%替代组最低;类志贺邻单胞菌的相对丰度在30%替代组最低,与对照组差异不显著,表明脱脂黑水虻幼虫粉替代30%的鱼粉可以改善中华鳖稚鳖的肠道菌群结构。

4 结 论

本试验条件下,脱脂黑水虻幼虫粉替代饲料中30%～45%的鱼粉不会对中华鳖稚鳖的生长性能产生负面影响,并能够改善肝脏抗氧化能力与肠道菌群结构。