张春晓,冉从国,徐志斌,王丽丽

(河北科技大学食品与生物学院,河北石家庄 050018)

重组蛋白对工业、医疗保健和可持续的生物经济发展具有重要意义,因此,建立高质、高量蛋白质高效生产平台很有必要[1]。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis,或B.subtilis)被认为是一种生物安全菌株,并且具有遗传稳定性高和蛋白分泌能力强等优点,常被用于细胞工厂生产工业、农业、医药等领域重组蛋白,如蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶等[2]。

枯草芽孢杆菌胞外蛋白分泌系统主要有一般分泌途径(Sec)、双精氨酸分泌途径(Tat)、ABC转运系统和非经典途径等[3],其中大部分蛋白质以Sec途径进行分泌。生命领域中绝大多数分泌蛋白在其N端携带短肽,一般含25～30个氨基酸残基,称为信号肽,就像全球定位系统一样,导向靶蛋白到达最终目的地[4-6]。信号肽包含N区、H区和C区3部分[1,3-4],带正电荷的N区,含有赖氨酸或精氨酸残基;疏水性H区,由一连串疏水残基组成,可能采用α-螺旋构象,在这个疏水核心区的中间,经常会出现螺旋断裂的甘氨酸或脯氨酸残基,从而形成一个可以插入膜的发夹状结构;亲水性C区,具有Ⅰ型信号肽酶识别位点,含Ala-x-Ala共识基序[1,3]。信号肽除了被相应的蛋白转位酶靶向和膜易位所需要外,还对相应的靶蛋白的生物合成、折叠动力学和稳定性有额外的影响[7],信号肽的净电荷、疏水性或长度的改变都会改变靶蛋白的分泌效率[8],且同一信号肽指导不同蛋白质的分泌效率存在很大差异[9],目前尚未建立预测靶蛋白最适信号肽的相关软件,因此,通过信号肽库的构建和筛选仍是提高目的蛋白分泌量的一种有效措施[9-10]。

在分析了N区正电荷数量、氨基酸组成及密码子偏好性等方面的研究后,笔者得出,N区不像信号肽的H区和C区保守、被研究得透彻,在信号肽优化中没有发挥主要作用[4]。信号肽C末端由形成β-螺旋的氨基酸组成,在切除位点上游具有保守的(-3,-1)规则或AXA基序,提供信号肽酶结合位点,涉及信号肽的切除[4]。尽管信号肽长度、电荷及疏水性不同,但其切除位点比较保守[4]。H区是信号肽研究的里程碑,其疏水性决定了:1)信号肽的构象及面向细胞膜的方向;2)信号肽的切除,影响蛋白质转位速率和效率;3)信号肽的蛋白质的分泌途径;4)蛋白质加工,如N连接的糖基化[4]。H区疏水氨基酸残基的类型、顺序和数量在不同生物中偏好性不同[4]。尽管很多研究在提高异源蛋白表达方面均对天然信号肽库进行筛选,并获得了较好的适合目的蛋白的信号肽[11-12],但不一定是最佳信号肽。因此,本研究以α-淀粉酶为例,将筛选得到的4种天然信号肽(SPyvcE,SPyoqM,SPBglS和SPyobB)的H区,替换SPsacB信号肽的H区,构建4种嵌合信号肽RSP1—RSP4,以期筛选出优于天然信号肽的嵌合信号肽,实现α-淀粉酶的更高效分泌。本研究有望为其他蛋白质的高效分泌提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料

本研究所用质粒包括pWB-manBl(I91N/L211I)[13],构建的pWB-amyL(SPsacB信号肽指导的α-淀粉酶表达载体)、pWB-SPn-amyL(天然信号肽指导的α-淀粉酶表达载体,n代表不同天然信号肽)和pWB-RSPx-amyL(嵌合信号肽指导的α-淀粉酶表达载体,x代表1,2,3,4)。所用菌株包括实验室保藏的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens),B.subtilisDB104[14]及新构建的α-淀粉酶表达菌株B.subtilis(pWB-amyL),B.subtilis(pWB-SPn-amyL)和B.subtilis(pWB-RSPx-amyL)。引物见表1。

表1 引物种类Tab.1 Primers

1.2 试剂与仪器

Fastpfu,dNTP,DNA Marker、蛋白Marker,分析纯,北京全式金生物技术有限公司提供;寡核苷酸引物,分析纯,英潍捷基(上海)贸易有限公司提供;玉米淀粉(生物试剂),沈阳雷仕淀粉有限公司提供;3,5-二硝基水杨酸(DNS,生物试剂)、D-葡萄糖(生物试剂)、刚果红染料(生物试剂)、琼脂粉(生物试剂),北京索莱宝科技有限公司提供;酵母粉、蛋白胨和胰蛋白胨、分析纯,OXOID公司提供。

ZWY-2102C振荡摇床,上海智城分析仪器制造有限公司提供;Biometra Tone梯度PCR仪,德国耶拿公司提供;Quantity One凝胶成像系统,美国BioRad公司提供;BIFUGE STRATOS高速冷冻离心机,美国GE公司提供;SpectraMaxm i3x 多功能酶标仪,美国 Molecular Devices 公司提供;恒温金属浴,杭州博日科技有限公司提供。

1.3 淀粉酶基因amyL扩增及其表达载体构建

以B.amyloliquefaciens基因组为模板,BFamy-5和BFamy-2为引物,扩增amyL基因,95 ℃ 2 min;95 ℃ 20 s,61 ℃ 20 s,72 ℃ 25 s;72 ℃ 5 min,32个循环。以Vlinker-1和VBFamy-2为引物,质粒pWB-manBl (I91N/L211I)为模板扩增载体片段,95 ℃ 2 min;95 ℃ 20 s,62 ℃ 20 s,72 ℃ 1 min,32个循环;72 ℃ 5 min;再将2个PCR片段采用POE-PCR方法进行扩增,95 ℃ 2 min;98 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s,68 ℃ 6 min;68 ℃ 10 min,35个循环。将POE-PCR产物转化至B.subtilisDB104感受态细胞,获得淀粉酶表达菌株B.subtilis(pWB-amyL)。

1.4 天然信号肽库的构建及筛选

1.4.1 天然信号肽基因克隆

依据文献报道的嗜热脂肪芽胞杆菌(B.stearothermophilus)淀粉酶AmyS分泌效果较好的15种信号肽(SPyvcE,SPyoqM,yuaB,pelA,pelB,yoaW,yqxI,lipA,estB,yoqH,ybfO,SPsacB,SPBglS,yddT,SPyobB ybxI)[10],本研究又增加了8种常用蛋白酶信号肽(aprE,nprB,bpr,mpr,epr,nprE,vpr,wprA)以及ybxI和amyE信号肽共25种天然信号肽进行克隆。以B.subtilisDB104基因组为模板,所用引物见表1。

1.4.2 载体扩增

以pWB-amyL质粒为模板,Vsip-1和Vsip-2为引物,扩增5.2 kb载体骨架片段用于扩增α-淀粉酶载体骨架,95 ℃ 2 min;95 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 1 min 30 s,5个循环;95 ℃ 20 s,61 ℃ 20 s,72 ℃ 1 min 30 s;72 ℃ 5 min。

1.4.3 天然信号肽与载体片段融合

天然信号肽和载体片段纯化后,将天然信号肽按分子量大小分为6组,通过POE-PCR方法克隆信号肽-载体骨架多聚体[15],95 ℃ 2 min;95 ℃ 20 s,56 ℃ 20 s,68 ℃ 6 min;35个循环,68 ℃ 10 min。将POE-PCR产物转入至B.subtilisDB104感受态细胞,获得淀粉酶天然信号肽库B.subtilis(pWB-SPn-amyL)。

1.4.4 天然信号肽库的筛选

将天然信号肽库转化产物平铺在刚果红筛选培养基上,于37 ℃恒温培养14 h进行初筛;从每组中挑取水解圈较大的10个克隆再次进行刚果红平板复筛,水解圈较大的进行24孔板培养并测定酶活力,并从每组中选取3个酶活力较高的克隆进行测序,鉴定信号肽种类。

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1.5 嵌合信号肽库的构建

4种嵌合信号肽RSP1—RSP4序列由北京六合华大基因科技有限公司提供,PCR扩增程序同天然信号肽。嵌合信号肽克隆所用引物为P25和P26,采用1.4.2方法构建B.subtilis(pWB-RSPx-amyL)。

1.6 重组菌株发酵

挑取每种枯草芽孢杆菌工程菌株3个单克隆于种子培养基,37 ℃ 180 r/min培养12 h;按10%比例转接至发酵培养基,相同培养条件下继续培养5 d,每隔1 d进行取样测定酶活力。

1.7 α-淀粉酶活力测定

采用DNS法测定α-淀粉酶活力[16]。不同工程菌粗酶液制备:取发酵液样品,调至相同OD600,12 000 r/min离心10 min,取上清液作为粗酶液。将玉米淀粉溶于pH 7.0的磷酸缓冲液,配制20 g/L的底物,在1.5 mL离心管中加入底物270 μL,再加入30 μL适当稀释的粗酶液,混合均匀后放入60 ℃恒温水浴锅,反应10 min,取出后迅速加入600 μL的DNS试剂,混合均匀后放入100 ℃沸水浴5 min,迅速取出进行冷水浴,测定样品540 nm吸光值。配制不同浓度的葡萄糖,与DNS试剂混匀,沸水浴5 min,测定OD540值并制备标准曲线。

1.8 信号肽结构预测

通过SigP 6.0进行信号肽N,H和C区的分析[17]。

1.9 数据处理

实验重复3次,采用SPSS软件进行显著性分析,p<0.05%差异性显著,p<0.01%差异性极显著。应用Origin 2021软件绘图。

2 结果与讨论

2.1 α-淀粉酶基因分析

α-淀粉酶基因扩增结果如图1所示,泳道1所示目的条带位置与期望的1 545 bp α-淀粉酶基因大小一致,通过POE-PCR构建载体pWB-amyL后,进行测序,结果表明与B.amyloliquefaciensα-淀粉酶基因(CP054415.1)一致性100%。该基因编码514个氨基酸。经SigP 6.0软件预测,前31个氨基酸为信号肽序列。

图1 α-淀粉酶基因的PCR扩增结果Fig. 1 PCR results of α-amylase

2.2 α-淀粉酶天然信号肽库的筛选

从每组转化平板中挑取透明圈较大的10个单克隆进行复筛,结果如图2所示,每个克隆所产透明圈有明显差异,每组挑取水解圈直径(D)与菌落直径(d)比值较大的3个菌落,进行液体培养,测定α-淀粉酶活力,共挑取10个酶活力较高的菌株进行测序,测序结果表明,筛选得到的对α-淀粉酶分泌效率较高的天然信号肽是SPyoqM,SPyobB,SPBglS,SPsacB,nprB和SPyvcE等6种信号肽。

图2 α-淀粉酶天然信号肽库复筛结果Fig. 2 2nd round screening for natural signal peptide library of α-amylase

注:与SPsacB信号肽相比,*表示差异性显著(p<0.05%);**表示差异性极显著(p<0.01%)。图3 不同信号肽指导的α-淀粉酶相对酶活力Fig. 3 Relative enzyme activity of α-amylase enzyme by different signal peptides

2.3 嵌合信号肽对α-淀粉酶分泌的影响

由于SPsacB是B.subtilis常用的信号肽,SigP 6.0预测结果表明其N区、H区和C区分别由MNIKKFAKQ,ATVLTFTTALL和AGGATQAFA短肽组成。本文以该信号肽为基础,将α-淀粉酶筛选得到的胞外酶活力较高的4种天然信号肽SPyvcE,SPyoqM,SPBglS和SPyobB的H区分别替换SPsacB的H区,构建嵌合信号肽RSP1,RSP2,RSP3和RSP4(如表2所示),以期通过α-淀粉酶信号肽N区、H区和C区的强强组合,实现α-淀粉酶更加高效分泌。

表2 嵌合信号肽H区组成Tab.2 Hydrophobic region of chimeric signal peptides

结果表明,筛选得到的适合α-淀粉酶的嵌合信号肽为RSP1,其指导的胞外α-淀粉酶活力达968.5 U/mL(见图3),较筛选的α-淀粉酶最适天然信号肽SPyoqM分泌效率提高27%;而其他嵌合信号肽RSP2,RSP3和RSP4指导的α-淀粉酶胞外酶活力约为SPsacB信号肽的10%左右。RSP1与SPsacB的N区和C区相同,仅H区不同,但RSP1指导α-淀粉酶的分泌效率是SPsacB的3.07倍;此外,尽管RSP1与SPyvcE信号肽H区相同,但RSP1指导α-淀粉酶的分泌效率为SPyvcE信号肽的4.6倍;SPyoqM与 RSP2相比,信号肽的H区相同但N区和C区不同,SPyoqM对α-淀粉酶的分泌效率是RSP2的21.9倍。SPsacB与4种嵌合信号肽对α-淀粉酶的分泌效率都达到极显著水平(p<0.01%)。图4 b)为发酵4 d的粗酶液电泳结果,只有嵌合信号肽RSP1指导的α-淀粉酶有明显的55.4 kDa的目的条带(图中黑色箭头所示),其他嵌合信号肽无明显的α-淀粉酶目的条带,与酶活力测定结果一致。应用嵌合信号肽指导外源蛋白的高效分泌报道较少,仅见对修饰的信号肽SPdsbA和SPpelB特定区域进行交换,在大肠杆菌(Escherichiacoli)中提高金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) Alpha toxinH35L的分泌[18],未见应用嵌合信号肽指导α-淀粉酶分泌的报道。

2.4 信号肽组成对蛋白分泌效率的影响

重组蛋白的产量,不仅与表达水平相关,也与转位效率相关,而分泌机器和信号肽,决定了蛋白的分泌效率[4]。同源或异源信号肽筛选、信号肽突变等策略,是提高靶蛋白产量的有效措施[10,19-20]。YANG等[21]应用信号肽工程包括信号肽优化、对信号肽SPywbN′删除29—45位肽段、在第4和第5位插入精氨酸R、降低H区疏水性等多项措施,并结合启动子工程及高密度发酵,使碱性α-淀粉酶产量提高250.6倍。信号肽的变化改变了易位效率、裂解位点,甚至裂解后过程[4]。

4种嵌合信号肽RSP1—RSP4的N区和C区均来自SPsacB,仅H区不同,其氨基酸组成见表2。首先,从疏水性氨基酸残基数目来看,RSP1和RSP3疏水性残基均为9,而RSP2,RSP4和SPsacB的疏水性残基个数为7,但RSP1指导α-淀粉酶的分泌效率远高于其他信号肽,说明疏水性氨基酸残基数目较多,分泌效率较高,这与H区疏水性降低、蛋白质的加工和转运将变慢或完全停止结论一致[4,22]。但不是疏水性残基越高越好,如果疏水性增加过多,大量具有非天然构象的未成熟蛋白会堵塞在转座酶后面,不仅会减少蛋白质的分泌,还会威胁细胞的生存能力[4]。其次,从疏水性氨基酸残基的分布来看,疏水性残基之间插入螺旋阻断(helix-breaker)残基,使疏水残基分布较均匀,优于集中分布。RSP1和RSP3的疏水性残基数目相同,但RSP1疏水性残基被螺旋阻断氨基酸G或S分割为4个区域,分布较均匀,而RSP3的疏水性残基集中分布在H区的两端,中间仅被1个G阻断,说明信号肽分泌效率不仅与疏水性残基数目多少有关,还与疏水性残基的分布相关。HAN等[18]认为高效信号肽在H区中间或C区附近具有疏水残基,如果疏水残基在N区附近则会降低分泌效率。DALBEY等[23]则指出,H区螺旋阻断残基G,P和S在H区中间的插入使信号肽形成发夹状结构,使信号肽更容易插入膜中并被SPase切割。再次,尽管H区在蛋白分泌过程中起着举足轻重的作用,但仅H区不能决定蛋白分泌效率。RSP1与SPyvcE的H区完全相同,但N区和C区不同,RSP1指导α-淀粉酶的分泌效率是SPyvcE的4.6倍;α-淀粉酶的最适天然信号肽SPyoqM与 RSP2相比,信号肽的H区相同但N区和C区不同,使得SPyoqM是RSP2的21.9倍。HAN等[18]也认为H区疏水残基与另外2个区域之间存在相互作用。总之,信号肽N,H和C区甚至目的蛋白之间与分泌机器共同作用,最终决定了靶蛋白的分泌效率。

3 结 语

本文提出将不同来源的天然信号肽N,H和C区进行组合构建嵌合信号肽的理念,且嵌合信号肽RSP1指导的α-淀粉酶分泌效率较最适天然信号肽SPyoqM提高了27%,表明嵌合信号肽是有效提高α-淀粉酶产量的一种方法。本研究对其他蛋白的高效分泌具有指导意义。枯草芽孢杆菌中蛋白分泌过程涉及多个环节和多种蛋白质,其中信号肽对目的蛋白分泌有着重要影响,但是,目前尚没有一种确定的信号肽能够指导任意靶蛋白的高效分泌,因此,需要对更多信号肽与靶蛋白分泌效率的数据进行分析,建立信号肽结构/序列与靶蛋白结构/序列之间的关联,开发靶蛋白分泌效率的信号肽预测软件,提高分泌效率和蛋白产量。