梁英业, 王天翊, 卢栋明, 唐宏亮, 陈 立, 苏梦洁, 何育风

神经病理性疼痛(neuropathic pain,NPP)是由躯体感觉神经系统损伤和功能紊乱而造成的疼痛综合征,是慢性疼痛的主要原因之一。有研究显示,NPP的人群患病率为3.3%～8.2%[1],而在50岁以上人群中达8.9%[2]。壮医经筋推拿疗法作为治疗疼痛的特色民族疗法,以“松筋解结”为基本原则,以“查灶术”和“松筋术”为特色,在治疗疼痛方面具有良好的疗效[3-5],但其起效机制尚不明确。鉴此,本研究以细胞焦亡为切入点,从NPP经典炎症通路阐明推拿镇痛的机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1 实验动物 健康成年无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级雄性SD大鼠45只,体重220～250 g,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。大鼠单笼适应性饲养7 d,室温20～25 ℃,湿度35%～45%,自由饮用自来水,饲用普通清洁鼠饲料,每日更换笼具与垫料。采用随机数字表法将其分为模型组、正常组、壮医经筋推拿组、假推拿组和假手术组,每组9只。动物实验经广西中医药大学实验动物伦理审查并批准(No.DW20220621-129)。

1.1.2 实验试剂 总RNA提取试剂Life TRIzol Reagent RNA(美国Life Invitrogen公司),逆转录酶GoScriptTMReverse Transcriptase[Promega(Beijing)Biotech Co.,Ltd],实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)混合试剂GoTaq® RT-qPCR Master Mix[Promega(Beijing)Biotech Co.,Ltd],乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)检测试剂盒(微板法,南京建成生物技术研究所),酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)。

1.1.3 仪器设备 YI-875型超净工作台(苏州净化设备厂),低温高速离心机(美国Sigma公司,型号:Sigma 3-18KS),酶标仪(美国伯乐公司,型号:Elx800),ND1000分光光度计(美国赛默飞公司,型号:ND-ONE-W),RT-qPCR仪(瑞士Roche公司,型号:Roche Light Cycler 96),实验动物模拟推拿仪器(专利号:ZL201420473452.7),触觉测量套件纤维丝(Von Frey纤维丝,美国IITC公司),热板痛觉测试仪(美国IITC公司)。

1.2实验方法

1.2.1 脊神经结扎(spinal nerve ligation,SNL)大鼠模型建造[6]对模型组、壮医经筋推拿组、假推拿组实施造模手术,建造SNL大鼠模型。大鼠术前12 h予以禁食,按每100 g体重给予0.4 ml 10%水合氯醛进行腹腔注射麻醉,以角膜反射消失为麻醉成功。将大鼠俯卧位固定于手术板上,定位两侧髂后上嵴,并以此为中心用电动剃刀在上、下3 cm范围剃毛备皮,常规消毒。在左侧髂后上棘与脊柱之间,做一平行于脊柱方向的纵行切口,长度约2 cm。将皮肤、筋膜、肌肉钝性分离,暴露L4-6脊椎左侧的横突,用咬骨钳夹断横突与椎体之间的连接,可看到2条并行的脊神经,钝性分离内侧脊神经,用5-0的可吸收性羊肠线双层结扎,此过程要尽量避免牵拉该神经。最后用生理盐水清洗手术创口,逐层缝合伤口。术后观察到大鼠足跖部有明显的外翻、跛行,行走时避免患肢着地等异常行为,以及大鼠在热痛测量板上出现舔食患肢、甩足行为,可在无任何刺激的情况下发生自发性的抬足反射,则提示SNL大鼠造模成功。假手术组在手术过程中仅暴露脊神经几分钟,但不予结扎;正常组不进行任何手术处理。

1.2.2 干预方法 (1)壮医经筋推拿组:壮医认为在疼痛周围会形成筋结,治疗要松筋解结。鉴此,研究者使用布袋束缚大鼠后应用按摩推拿手法模拟仪依次刺激脊神经结扎节段对应的体表部位(即环跳穴),以及所结扎神经支配区域(以1 cm为间隔)。腰椎间盘突出症疼痛部位往往是腰部及下肢,再选择2个治疗点(即阳陵泉穴、悬钟穴)。推拿手法为临床常用的松筋解结手法(点法、拨法、揉法),刺激力量为4 N。按摩推拿手法模拟仪的按摩头选用直径为10 mm的圆形光滑接触面头,每法、每处干预1 min。每只大鼠每日予3处、3法,总计9 min,连续干预14 d。(2)假推拿组:使用布袋束缚大鼠并轻轻抚摸其双后肢,每天予以9 min干预,连续干预14 d。(3)正常组、假手术组和模型组不进行干预,连续观察14 d。

1.2.3 大鼠机械缩足反射阈值(paw withdrawal mechanical thresholds,PWMT)测定[7]于术前,以及术后1 d、3 d和14 d测定各组大鼠PWMT。在室温25 ℃的环境下,将大鼠置于四周粘上红纸、底层为铁丝网的笼子内。待大鼠适应15 min后,采用VonFrey纤维丝依次加大力度刺激手术侧后肢足底中部,每次持续刺激时间为3～4 s。检测3次,每次间隔5 min。记录纤维丝显示的大鼠最小PWMT,取3次测定的平均值。

1.2.4 大鼠热刺激回缩潜伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL)测定[8]于术前,以及术后1 d、3 d和14 d测定各组大鼠的PWTL。环境温度为25 ℃,热板痛觉测试仪调至(55.0±0.2)℃。将大鼠放置于测试仪的封闭且透明玻璃盒内,启动计时器。当观察到大鼠出现快速抬足、频繁舔足等现象时停止计时并记录。连续测定3次,每次间隔5 min。取平均值作为PWTL,即大鼠对热刺激的反应时间。

1.2.5 组织标本取材 各组大鼠在术后14 d完成上述行为学观察后,按照每100 g体重给予0.4 ml的水合氯醛(10%)对大鼠进行腹腔注射麻醉,采血后将其断头处死,用铡刀将大鼠胸段及以上和L6以下切断,仅保留腰段(L2-6),并迅速取出L4-6脊髓背角组织。经液氮冷却后转移至-80 ℃保存备检。

1.2.6 大鼠背根神经节caspase-1表达水平检测 通过TRIzol法提取各组大鼠L4-6脊髓背角的一部分组织中的总RNA,实验操作严格按照试剂盒说明书进行。使用NanoDrop仪器测定RNA浓度和纯度。采用GoScriptTMReverse Transcriptase试剂盒将RNA反转录成cDNA,并以cDNA为模板进行RT-qPCR,反应总体积为20 μl:Nuclease-Free Water 7.2 μl;上、下游引物各0.4 μl;GoTaq® RT-qPCR Master Mix 10 μl;cDNA 2 μl。反应条件为两步扩增法:第一步为预变性95 ℃10 min;第二步为变性扩增95 ℃15 s,退火温度为60 ℃ 1 min,共40个循环。所用引物序列见表1,由南宁捷尼斯生物科技有限公司合成。实验重复3次,采用2-ΔΔCt法计算caspase-1的相对表达水平。

1.2.7 血清白细胞介素(interleukin,IL)-18表达水平检测 采集各组大鼠腹主动脉血后,在4 ℃下以3 000 r/min离心15 min,收集上层血清。应用ELISA检测试剂盒测定血清IL-18的表达水平。实验重复3次,应用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值。

1.2.8 血清中LDH水平检测 采集各组大鼠腹主动脉血后,在4 ℃下以3 000 r/min离心15 min,收集上层血清。严格按照LDH检测试剂盒(微板法)的说明书步骤进行血清LDH水平测定。实验重复3次,应用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值。

2 结果

2.1五组大鼠各时间点PWMT比较 术前,五组大鼠PWMT比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后1 d、3 d,与正常组比较,其余四组的PWMT显著降低(P<0.05);术后14 d,模型组和假推拿组的PWMT显著低于正常组,壮医经筋推拿组的PWMT显著高于模型组和假推拿组(P<0.05)。见表2。

表2 五组大鼠各时间点PWMT比较

2.2五组大鼠各时间点PWTL比较 术前,五组大鼠的PWTL比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后1 d、3 d,与正常组比较,其余各组的PWTL均显著降低(P<0.05)。术后3 d,模型组和假推拿组的PWTL均较假手术组、壮医经筋推拿组显著降低(P<0.05),而壮医经筋推拿组和假手术组的PWTL比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后14 d,壮医经筋推拿组的PWTL高于模型组、假推拿组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 五组大鼠各时间点PWTL比较

2.3五组大鼠干预14 d后脊髓背角caspase-1表达水平比较 壮医经筋推拿组、假推拿组和模型组中脊髓背角中caspase-1的表达水平较正常组显著升高(P<0.05)。与模型组和假推拿组相比,壮医经筋推拿组caspase-1的表达水平显著下调(P<0.05)。正常组与假手术组caspase-1表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

注:与正常组比较,aP<0.05;与假手术组比较,bP<0.05;与壮医经筋推拿组比较,cP<0.05

2.4五组大鼠干预14 d后血清IL-18水平比较 模型组的血清IL-18水平较正常组显著升高(P<0.05)。与模型组、假推拿组相比,壮医经筋推拿组血清IL-18的表达水平显著下调(P<0.05),正常组与假手术组血清IL-18水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

注:与正常组比较,aP<0.05;与假手术组比较,bP<0.05;与壮医经筋推拿组比较,cP<0.05;与假推拿组比较,dP<0.05

2.5五组大鼠干预14 d后血清LDH表达水平比较 模型组血清LDH水平较正常组显著增高(P<0.05)。与模型组、假推拿组相比,壮医经筋推拿组大鼠血清LDH水平显著下调(P<0.05)。见图3。

注:与正常组比较,aP<0.05;与假手术组比较,bP<0.05;与壮医经筋推拿组比较,cP<0.05;与假推拿组比较,dP<0.05

3 讨论

3.1NPP的主要特征包括自发性疼痛、痛觉过敏、痛觉超敏。组织在发生损伤时,受损区域的细胞会释放出炎症介质,伤害性刺激也可以导致神经源性的炎症反应,神经炎症是多种中枢神经系统疾病的共同病理特征[9]。在炎性疼痛的产生和维持过程中,促炎因子起到了敏化疼痛的作用。近期研究表明,在造成NPP的脊髓机制中,神经损伤时,通过特异性受体介导而被激活的神经胶质细胞表型结构及功能均发生变化,并释放大量肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、神经活性物质、IL等促炎细胞因子。在外周及中枢敏化的途径中,神经损伤导致肥大细胞和巨噬细胞等免疫细胞渗出、交感神经兴奋以及血管扩张,使外周和中枢产生组胺、缓激肽、神经生长因子、IL、TNF等促炎细胞因子[10]。它们可以通过炎性介质调控细胞膜表面不同离子通道的活性,并促进中枢敏化,导致痛觉过敏、异常性疼痛。

3.2近年来,国内学者已从细胞自噬、干扰素、蛋白酶抑制剂、miRNA等多个层面研究了炎症的调控机制[11-13]。但由于炎症的发生机制及调控的复杂性,现有的研究不足以解决临床问题。近期有研究表明,当细胞发生焦亡时,细胞膜水解破裂会释放其细胞内容物和促炎因子,包括IL-18等,产生炎性疼痛[14]。细胞焦亡作为一种新发现的程序性细胞死亡方式,其与细胞凋亡的区别在于它不依赖于细胞凋亡相关蛋白caspase-3,而是由caspase-1介导促炎形式的程序性细胞死亡,其特征在于快速的质膜破裂[15],释放细胞内容物,诱发级联放大的炎症反应[16]。研究发现,细胞焦亡存在两条途径(细胞受到的刺激不同,所诱发的途径也不同):介导caspase-1活化的经典通路和促进caspase-11活化的非经典通路。caspase-1具有活化IL-18和IL-1β的功能[17]。在细胞焦亡的经典炎症通路中,caspase-1是以活性的酶原形式存在,在与多蛋白复合物炎性小体结合并被激活后,裂解成具有活性的caspase-1。随后,caspase-1裂解GSDMD。GSDMD是由gasdermin家族的GSDMD基因编码的胞浆蛋白,在不同细胞和组织中被广泛表达,在免疫相关疾病中具有重要的作用[18],是caspase-1和caspase-4/5/11的通用底物[19]。在caspase-1裂解GSDMD后,释放N-末端结构域,与质膜的内部小叶结合并寡聚形成直径12～14 nm的膜孔[20]。这些膜孔是胞内物质(包括炎性因子、LDH等)流出的重要途径。当这些膜孔的数量显著增多时,导致细胞显著肿胀并伴随膜破裂,胞内物质流出。流出的IL-18前体裂解并诱导其他炎性因子、黏附分子等的合成和释放,放大局部和全身炎症。

3.3壮医经筋的理论认为人体受到外界环境邪毒入侵或体内致病因素的作用,导致“三道两路”(即气道、谷道、水道以及龙路、火路)通道功能障碍,使得人体肌筋系统发生病变,“三气”(即人体上、中、下三部之气)不能同步而导致全身性的连锁反应,使得单纯型或复合型的肌肉筋结出现急慢性损伤,表现为疼痛、有形的病理改变,以及功能异常导致的酸胀、僵硬、活动受限等经筋“病灶”症候群[21]。鉴此,壮医提出“因结致痛”,而在经筋病的治疗上注重“经筋病灶”的探查与松解,从而形成了一套独特的壮医经筋疗法。壮医经筋疗法以解除病痛消除经筋病灶为目的,采用独特的理筋手法、针具刺筋、经络拔罐等治疗方式,临床运用广泛,疗效显著。本研究通过按摩推拿手法模拟仪采用临床常用松筋解结手法松解SNL大鼠的筋结,检测大鼠的疼痛行为学表现及大鼠脊髓背角组织的细胞焦亡相关指标改变情况。结果显示,推拿干预后第1天、第3天,模型组、壮医经筋推拿组、假推拿组的PWMT比较差异无统计学意义,提示短时间的推拿干预对SNL模型大鼠的PWMT影响并不显著。在推拿干预后第14天,壮医经筋推拿组PWMT显著高于模型组和假推拿组;而在推拿干预后第3天,壮医经筋推拿组的PWTL即显著高于模型组和假推拿组(P<0.05)。提示短时间的推拿干预即可有效缓解SNL模型大鼠的PWTL,其疗效反应较PWMT更为敏感。在推拿干预后第14天,模型组caspase-1、IL-18及LDH水平较正常组、假手术组显著增高(P<0.05)。与模型组、假推拿组相比,壮医经筋推拿组caspase-1、IL-18及LDH的表达水平显著下调(P<0.05)。由此笔者推测:(1)脊神经损伤刺激因素促使脊髓部位caspase-1蛋白表达升高,进而使细胞发生焦亡、破裂,胞内物质炎性因子IL-18以及细胞焦亡标志物LDH流出,故术后第14天模型组caspase-1及血清IL-18、LDH水平较正常组显著增高。(2)假推拿作为一种安慰对照,可以使大鼠情绪得到安抚,疼痛状态有所缓解,生物因子水平得到轻微改善,但效果远不如推拿组。(3)壮医经筋推拿能够下调SNL模型大鼠脊髓背角组织caspase-1蛋白的表达,抑制细胞焦亡,抑制IL-18、LDH分泌,从而达到抑炎镇痛的目的。

综上所述,壮医经筋推拿可减轻NPP大鼠的痛觉过敏反应,其可能通过抑制caspase-1的表达,调控细胞焦亡,进而阻碍炎症因子IL-18、LDH的分泌,达到抑制炎症镇痛效果,从分子水平进一步阐释了壮医经筋推拿的镇痛机制。但本研究对于何种因素诱导caspase-1的表达和激活,以及上游分子事件尚未能详细阐明,后续还需深入研究。