蔡 瑾，闫 然，王梦亮，王 琪

（1.山西大学应用化学研究所，山西 太原 030006；2.山西大学中医药现代研究中心，山西 太原 030006；3.山西大学 化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西 太原 030006；4.山西大学生命科学学院，山西 太原 030006）

食品工业是国民经济的重要组成部分。随着我国经济的发展，食品的质量和安全问题愈发引起人们的关注，其中由大肠杆菌等食源性病菌导致的食品安全问题尤为突出。食用被大肠杆菌污染的食物往往会造成伤害，如群发性腹泻、呕吐等[1]。食品中添加防腐剂可以抑制食物源病菌的增长，有效避免食物源病菌对人体造成的危害[2]。食品防腐剂主要分为两类，即化学防腐剂和天然防腐剂[3]。化学防腐剂是在食品中使用最广泛的一类防腐剂，但其具有一定的致畸性、致癌性，残存在食品中也会对环境产生影响[4-5]；天然防腐剂是从植物、动物和微生物中获得的具有抗菌和防腐活性的物质，安全性高且对环境友好[6]。天然植物防腐剂的主要成分种类繁多、绿色健康且具有良好抗菌性能，可从植物的根、茎、叶等处提取得到[7]。植物源食品防腐剂符合现代社会对绿色健康消费新趋势的追求[8]。

二氢槲皮素（dihydroquercetin，DHQ），也称黄杉素、紫杉叶素、花旗松素，是一种从植物中提取出的二氢黄酮醇类化合物，广泛存在于松科、蔷薇科等植物中[9-10]。有多项研究表明DHQ具有抑菌活性[11-13]，在食品工业领域可作为食品防腐剂[14-16]。但是目前鲜见DHQ抑菌机理相关研究的报道，因此本研究测定了DHQ对常见食源性病菌的抑制活性，在确定大肠杆菌作为指示菌的基础上，观察大肠杆菌被DHQ作用后的形态变化，检测其胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平、细胞受损伤程度、膜电位变化、胞内Ca2＋含量以及细胞周期变化，进而分析大肠杆菌受DHQ抑制的机理。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus、ATCC 25923）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis、ATCC 6633）。革兰氏阴性菌：大肠杆菌（Escherichia coli、ATCC 25922）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris、ATCC 13315）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes、ATCC 13048）。酵母菌：热带假丝酵母菌（Candida tropicalis、ATCC 750）。所有菌种均保藏于山西大学微生物学实验室。

供试培养基：细菌培养基（营养琼脂（nutrient agar，NA）培养基、营养琼脂肉汤（nutrient broth，NB）培养基）；酵母菌培养基（酵母甘露醇琼脂（yeast mannitol agar，YMA）培养基、酵母甘露醇肉汤（yeast mannitol broth，YMB）培养基）。

戊二醛、罗丹明123（rhodamine 123，RH-123）、醋酸铀、柠檬酸铅 德国Sigma公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）天津市大茂化学制剂厂；2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯荧光探针（2’,7’-dichloro dihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）南京建成生物工程研究所；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（annexin V-fluorescein isothiocyanate isomer/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI）试剂盒 苏州宇恒生物科技有限公司；钙荧光探针（fluo-4 acetoxymethyl ester，Fluo-4 AM）美国Invitrogen公司；碘化丙啶/核糖核酸酶（propidium iodide/ribonuclease，PI/RNase）染色缓冲液 美国Becton dickinson公司。

1.2 仪器与设备

FACS Calibur流式细胞仪 美国Becton dickinson公司；JSM-35C扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）、JEM-1011透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培养

在NB培养基中接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌，摇床培养（160 r/min、37 ℃、12 h）；将热带假丝酵母菌接种在YMB培养基上，摇床培养（160 r/min、25 ℃、12 h）。

1.3.2 抑菌活性检测和最低抑菌浓度测定

DHQ对上述6 种食源性细菌的抑制活性通过琼脂板打孔法测定[17]。用20%（体积分数，下同）DMSO助溶DHQ，加入到无菌水中，使DHQ的质量浓度达到8 mg/mL。将1.3.1节的菌液用生理盐水稀释至108CFU/mL。在相应的固体培养基上均匀涂布各受试菌液200 µL，用10 mm打孔器在培养基上对称打两个孔。在一个孔中加入上述质量浓度为8 mg/mL的DHQ溶液200 µL，另一个孔加入200 µL的20% DMSO作为阴性对照。5 种细菌培养条件为37 ℃、24 h，热带假丝酵母菌培养条件为25 ℃、48 h，培养后测量抑菌圈直径。

DHQ对上述6 种食源性致病菌的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）使用96 孔板测定[18]。用含7% DMSO液体培养基溶解DHQ，利用二倍稀释法，使DHQ质量浓度范围达到20～0.02 mg/mL。在96 孔板的各孔中加入200 µL含上述不同质量浓度的DHQ液体培养基和5 µL（108CFU/mL）的菌液。阴性对照为只含7% DMSO液体培养基和5 µL菌液，不加DHQ样品。5 种细菌的培养条件为37 ℃、24 h，热带假丝酵母菌的培养条件为25 ℃、48 h。培养后用肉眼观察孔中菌液的浊度，选定使菌液澄清透明的最低DHQ质量浓度为MIC。

根据抑菌活性和MIC实验的结果，确定下一步实验的指示菌。

1.3.3 SEM和TEM观察

使用SEM和TEM来观察大肠杆菌被DHQ抑制后的外部形态及内部结构变化。将DHQ溶解于含0.8% DMSO液体培养基中，使DHQ的最终质量浓度达到1/2 MIC、MIC和2 MIC，并以仅含0.8% DMSO的液体培养基作为阴性对照。吸取100 µL的1.3.1节培养的大肠杆菌菌液（108CFU/mL）加入到100 mL上述液体培养基中，摇床培养（120 r/min、37 ℃、12 h）。样品8 000 r/min离心5 min后，弃去上清液，用2.5%戊二醛在4 ℃下固定过夜，然后用1% OsO4固定3 h。

SEM观察：固定的样品依次用体积分数30%、50%、70%和100%乙醇溶液做脱水处理20 min。处理后的样品在-80 ℃下冷冻干燥，离子喷金，用SEM观察细胞表面形态。

TEM观察：用Epon 618渗透包埋固定后的样品，进行切片处理。用醋酸铀和柠檬酸铅将切片进行双染色，两种染色剂各染15～30 min，用TEM观察菌体内部结构变化。

1.3.4 胞内ROS水平检测

根据1.3.3节方法培养菌液，在2 000 r/min下离心10 min，收集菌体，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.2～7.4，下同）洗两次后，悬浮在20 μmol/L DCFH-DA溶液中，避光孵育（37 ℃、20 min）。3 000 r/min离心5 min收集菌体，PBS洗涤两次后重悬，在激发波长488 nm及发射波长535 nm的条件下使用流式细胞仪测定其ROS水平。

1.3.5 Annexin V-FITC/PI检测

根据1.3.3节方法培养菌液，在2 000 r/min离心10 min，收集菌体并重新悬浮在PBS中。根据Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书所述方法处理重悬液，避光孵育（37 ℃、20 min），在3 000 r/min下离心5 min，收集菌体，PBS洗涤两次后重悬，使用流式细胞仪在激发波长488 nm及发射波长530 nm的条件下测定细胞受损程度。

1.3.6 细胞膜电位检测

按1.3.5节方法得到PBS重悬后的菌液，加入RH-123使染液浓度达到20 μmol/L，避光孵育（37 ℃、20 min），3 000 r/min离心5 min，收集菌体，用PBS洗两次后重新悬浮，使用流式细胞仪在激发波长507 nm，发射波长529 nm的条件下测定样品的膜电位。

1.3.7 胞内Ca2＋含量测定

按1.3.5节方法得到PBS重悬后的菌液，加入Fluo-4 AM使染料终浓度达到4 μmol/L，避光孵育（37 ℃、30 min），3 000 r/min下离心5 min，收集菌体，用PBS洗两次后重新悬浮，细胞内Ca2＋含量使用流式细胞仪在激发波长490 nm、发射波长520 nm的条件下测定。

1.3.8 细胞周期分析

按1.3.3节方法培养得到菌液，2 000 r/min离心10 min，收集菌体，PBS洗涤两次后在4 ℃下用体积分数75%乙醇溶液固定过夜后，3 000 r/min离心5 min，将菌体重悬于质量浓度为50 μg/mL的含有RNase的PI缓冲液，避光孵育30 min，在激发波长488 nm及发射波长530 nm的条件下使用流式细胞仪测定样品细胞周期。

1.4 数据处理与分析

所有上述实验都平行进行3 次。用SPSS软件对数据进行方差分析（ANOVA）或t检验。图中数据表示为平均值±标准差。使用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 DHQ对6 种食源性病菌的抑菌活性

对各供试菌的实验组及阴性对照组两者之间的抑菌圈直径进行t检验，图1结果表明DHQ对6 种食源性病菌的抑菌圈直径均在10 mm以上，均显著大于阴性对照的抑菌圈直径（P＜0.05），即DHQ对6 种食源性病菌均有显著的抑制效果（P＜0.05）。经ANOVA分析确定DHQ对6 种食源性病菌抑制作用强弱差异，结果表明DHQ对大肠杆菌有最佳的抑制作用（21.13 mm）（P＜0.05），对普通变形杆菌和热带假丝酵母菌的抑制作用次之（18.88、18.40 mm），对枯草芽孢杆菌以及产气肠杆菌的抑制作用较弱（14.67、13.90 mm），抑制金黄色葡萄球菌的作用最弱（12.35 mm）。

图1 DHQ对食源性致病菌的抑制活性Fig.1 Antimicrobial activities of DHQ against foodborne pathogens

美国临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute/National Committee for Clinical Laboratory Standards，CLSI/NCCLS）[19]规定，可以在不搅拌的情况下用肉眼观察并判断MIC，将抑制程度划分为5 个等级：0级，肉眼未见生长或观察澄清（100%抑制）；1级，肉眼可见轻微模糊（80%抑制）；2级，浊度明显降低（50%抑制）；3级，浊度轻微降低（轻微抑制）；4级，浊度未降低（无抑制）。如表1所示，当DHQ对金黄色葡萄球菌和产气肠杆菌的处理质量浓度为0.02～1.25 mg/mL时，培养基呈现不同程度的浑浊现象；当处理质量浓度为2.5～20 mg/mL时，培养基清澈，没有病菌生长，因此质量浓度2.5 mg/mL被确定为DHQ对金黄色葡萄球菌和产气肠杆菌的MIC。当DHQ以0.020～0.625 mg/mL的质量浓度处理枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌和热带假丝酵母菌时，培养基表现出不同的浑浊度；当处理质量浓度为1.25～20.00 mg/mL时，培养基是清澈的，确定DHQ对枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌和热带假丝酵母菌的MIC为1.25 mg/mL。当DHQ对大肠杆菌的处理质量浓度为0.020～0.313 mg/mL时，培养基出现浑浊现象；当处理质量浓度为0.625～20.000 mg/mL时，没有病菌生长，确定0.625 mg/mL为DHQ对大肠杆菌的MIC。

表1 DHQ对食源性致病菌的MICTable 1 Minimum inhibitory concentration of DHQ against foodborne pathogens

结合抑菌圈直径和MIC检测结果，可以看出DHQ对大肠杆菌具有最强的抑制活性，因此选择大肠杆菌作为进一步研究DHQ抑菌机理的指示菌。

2.2 DHQ对大肠杆菌细胞形态及结构的影响

SEM和TEM的结果能够直观地反映大肠杆菌被DHQ破坏的情况（图2）。对照组中大肠杆菌细胞表面光滑，呈现出规则的杆状结构（图2A-1、图2E-8）。经DHQ处理后，大肠杆菌的形态与对照组相比有明显不同（图2B～D、F～H）。图2B、F为由1/2 MIC的DHQ处理的大肠杆菌，虽然有些菌体细胞形态完好，但已经开始出现溶胀聚集现象（图2B-2），内容物溢出形成了空洞（图2F-9、10），有些细胞出现轻微的质壁分离现象（图2F-11）。经质量浓度为MIC的DHQ处理（图2C、G）后，细胞出现折叠黏连现象（图2C-3、4、5），亦有空泡结构（图2G-12），质壁分离明显（图2G-13）。大肠杆菌被2 MIC的DHQ处理后，亦有折叠现象（图2D-6），菌体结构出现明显的变形（图2H-14、15）、破裂（图2H-16）、降解（图2D-7）。DHQ的化学名为3,5,7,3’,4’-五羟基-2,3双氢黄酮醇，具有黄酮类化合物的基本结构。DHQ的多羟基位于其结构内部斥电子的大P-π共轭体系中，羟基中的氢原子容易脱离。因此，推测DHQ作用大肠杆菌后，羟基中的氢原子可能与细胞膜中的磷脂分子以氢键的形式相结合，使得膜结构变得疏松[20-21]，导致膜通透性增加，出现菌体肿胀、质壁分离等现象。当DHQ的质量浓度进一步增加，菌体结构变形，并出现黏连破裂等现象。

2.3 DHQ对大肠杆菌细胞内ROS水平的影响

ROS是生物细胞在代谢过程中产生的一种有氧代谢物，它能维持细胞内氧化还原平衡，与细胞的生长和死亡密切相关[22]，ROS水平失衡将会引发细胞的一系列功能障碍。DCFH-DA自身不会发出荧光，能够自由进出细胞，并能在细胞内被水解为DCFH，DCFH不能穿透细胞膜，使探针更易在细胞内被装载。无荧光的DCFH能够被ROS氧化为有荧光的DCF，因此细胞内的ROS水平可以通过DCF的荧光强度反映。

由图3可知，与对照组荧光强度（36.65）相比，DHQ处理组的荧光强度分别增加到了41.14（1/2 MIC）、56.99（MIC）以及65.94（2 MIC）。经DHQ处理的大肠杆菌细胞的荧光强度显著高于阴性对照的荧光强度（P＜0.05）。ROS主要通过氧化呼吸链产生和累积。细菌的呼吸作用主要由细胞膜上相关的酶催化反应进行，因此细胞膜是细菌产生ROS的主要位点。经DHQ处理后，DCFH-DA探针的荧光强度显著增强，推测DHQ可以刺激胞内的ROS过度产生。细胞膜中的脂质会因为过多的ROS而过氧化，导致细胞膜的流动性降低[23-25]。

图3 不同质量浓度DHQ作用下大肠杆菌胞内ROS水平Fig.3 Intracellular ROS levels of Escherichia coli under different mass concentrations of DHQ

2.4 DHQ对大肠杆菌细胞膜通透性和完整性的影响

磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）通常位于细胞膜的内侧，并会在细胞受损的早期阶段从细胞膜的内侧向外侧移动；Annexin V是一种磷脂结合蛋白，具有与PS特异性结合的高亲和力。Annexin V被FITC荧光素标记后可以作为荧光探针，用于定量检测PS从内侧向外侧的转移，可在流式细胞仪中检测细胞受损的进展情况[26]。PI是一种核酸染料，在细胞膜的完整性受到破坏后会将核酸染成红色[27]。因此，以Annexin V-FITC/PI染色后可以通过流式细胞仪检测出大肠杆菌活细胞、受伤细胞和死亡细胞。AnnexinV-FITC/PI双标记图显示4 种不同状态的细胞，左下（LL）、右下（LR）、右上（UR）、左上（UL）分别表示活细胞、受伤细胞、死细胞、坏死细胞与碎片[28]。

结合图4A～D可以看出，大肠杆菌在LL区的占比随着DHQ质量浓度的增加而逐渐减少，而LR区域大肠杆菌的占比增加。从图4E、F可以看出，与阴性对照相比，MIC和2 MIC DHQ处理后，正常的大肠杆菌占比显著下降（P＜0.05），受损细胞占比显著上升（P＜0.05）。由此推测，DHQ的处理可以使大肠杆菌细胞膜的通透性增加，完整性被破坏，从而影响细胞的正常生理活动，使活细胞减少。

图4 不同质量浓度DHQ作用下大肠杆菌细胞膜的通透性Fig.4 Evaluation of cell membrane permeability of Escherichia coli under different mass concentrations of DHQ

2.5 DHQ对大肠杆菌细胞膜电位的影响

膜电位是由细胞膜内外电势差产生的，反映了菌体新陈代谢。因此，细胞膜电位是细胞的一种功能性参数，在细菌代谢活动中起着重要作用，可反映细胞膜的完整性和菌体生理状态[29]。RH-123是一种阳离子亲脂性荧光物质，可以通过跨膜电位进入细胞，其荧光强度通过流式细胞仪检测后可反映膜电位的变化[30]。如图5所示，阴性对照表现出较强的荧光强度，为68.97，随着DHQ质量浓度的增加，荧光强度逐渐降低，1/2 MIC、MIC、2 MIC DHQ处理后的大肠杆菌荧光强度分别为43.38、35.07、34.69。与阴性对照相比，DHQ处理后的大肠杆菌细胞荧光强度显著降低（P＜0.05）。以上结果表明，RH-123进入细胞内的动力减弱，即细胞膜内外电势差减少，由此可以推测出DHQ会引起大肠杆菌细胞膜去极化，使膜电位降低，进一步造成胞内离子紊乱，细胞的正常生理功能受到损伤。

图5 不同质量浓度DHQ作用下大肠杆菌细胞膜电位水平Fig.5 Cell membrane potential levels of Escherichia coli under different mass concentrations of DHQ

2.6 DHQ对大肠杆菌细胞内Ca2＋含量的影响

胞内Ca2＋是一种调节细胞功能的重要因子，可以作为第二信使广泛参与细胞运动、代谢等多种功能活动，还参与维持细胞跨膜运输[31]。如图6所示，与对照组的荧光强度（44.31）相比，DHQ处理组的荧光强度减少到了33.13（1/2 MIC）、29.82（MIC）以及28.33（2 MIC）。大肠杆菌被DHQ处理后的荧光强度与阴性对照相比显著降低（P＜0.05）。在正常细胞中，胞内Ca2＋的含量处在稳定水平，当细胞膜通透性受损后，会导致Ca2＋的外漏。因此，胞内Ca2＋含量的变化可以反映出细胞膜通透性的变化。以上结果表明DHQ处理后的大肠杆菌胞内Ca2＋含量减少，推测DHQ可导致细胞膜损伤、Ca2＋外漏，并直接影响到由Ca2＋所参与的菌体的正常生长代谢和功能活动。

2.7 DHQ对大肠杆菌细胞周期的影响

原核细胞周期中的I期为DNA复制准备期，R期为DNA复制期。图7显示了DHQ处理后对大肠杆菌细胞周期的影响。经DHQ处理后，处于I期的大肠杆菌占比从82.99%（阴性对照）下降到了73.26%（1/2 MIC）、71.96%（MIC）、64.84%（2 MIC），处于R期的大肠杆菌占比从17.01%（阴性对照）上升到了26.74%（1/2 MIC）、28.04%（MIC）、35.16%（2 MIC）。DHQ处理后大肠杆菌处于I期的占比与对照组相比显著下降（P＜0.05），处于R期的占比显著上升（P＜0.05）。以上结果表明，DHQ对大肠杆菌的抑制作用与其干扰细胞周期有关。推测原因可能为DHQ损伤菌体的细胞膜，进入细胞内部，引起ROS在菌体内聚集，破坏了与DNA合成有关的酶或蛋白质，从而干扰了大肠杆菌正常的细胞周期[32]。

3 结论

从植物中提取的DHQ可以抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌和热带假丝酵母菌的生长，其中对大肠杆菌的抑菌效果最好，所以选择大肠杆菌作为抑菌机理实验的指示菌。DHQ会使得菌体内ROS含量增加，细胞膜的完整性和通透性受到损坏，细胞严重变形，出现黏连、折叠等现象；细胞膜电位降低，发生去极化现象，造成胞内离子紊乱，导致Ca2＋等离子外漏，影响细胞生长代谢；使细胞周期滞留在R期，正常的细胞周期受到了干扰。本实验证实了DHQ对大肠杆菌等食源性病原菌具有显著抑制活性，并阐述了其抑菌机理。实验结果可为DHQ作为植物源食品防腐剂应用于食品安全领域提供理论参考。