戴全武，刘 毅，曾格格，田 宇，黄振阳

（湖北中医药大学药学院/湖北省药用植物研发中心，武汉 430065）

中药桂枝为樟科植物肉桂（Cinnamomum cassiaPresl）的干燥嫩枝，味辛、甘，性温，有发汗解肌、温经筋脉、助阳化气的功效，本品以生用为主，生品桂枝辛散温通作用较强［1，2］。中药白芍来源于毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora）的干燥根，味苦、酸，微寒，有养血调经、敛汗止阴、平肝止疼的功效［3］。桂枝-白芍药对最早出现在《伤寒论》的桂枝汤中，是典型的相制药对，二药相合，一收一散，相互制约，为临床常用的调和营卫、温通止痛药对［4］。桂枝-白芍药对是桂枝汤及其类方的功效基础，常用于营卫不和、外感风寒等症，在临床治疗中应用广泛，疗效显著［5］。桂枝和白芍均含有大量的挥发性成分，在临床上有重要的应用价值［6，7］，使用顶空固相微萃取（HS-SPME）与气相色谱-质谱（GC-MS）联用法（HS-SPME-GC-MS）分析桂枝、白芍配伍前后挥发性成分的报道较少。HS-SPME 技术是集样品的萃取、浓缩、进样功能于一体的高效前处理方法［8］。因此本研究采用HS-SPME-GC-MS 联用法对比分析桂枝、白芍配伍前后的挥发性成分变化，以期为桂枝-白芍药对的配伍规律及其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

桂枝（批号210701）和白芍（批号210901）购于湖南省松龄堂中药饮片有限公司，经湖北中医药大学生药教研室杨红兵教授鉴定为樟科植物肉桂的干燥嫩枝和毛茛科植物芍药的干燥根。将桂枝和白芍药材分别打粉，过四号筛备用。

1.2 仪器

手动固相微萃取（SPME）进样装置（德国IKA 公司）；ThermoFisher Trace 1310 型气相质谱联用仪（美国ThermoFisher 公司）；顶空瓶（15 mL）；65 μm 聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯（PDMS/DVB）萃取纤维头（美国Supelco 公司）；ALC-210.2 型百分之一电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）。

1.3 气相色谱-质谱（GC-MS）条件

1）GC 条件。色谱柱：TG-1701MS 毛细管柱；升温程序：从50 ℃开始，保持2.5 min，以10 ℃/min 升温至250 ℃；载气：高纯度He（99.999 %）；柱流速：1.0 mL/min；进样口温度：250 ℃。

2）MS 条件。EI 源；电子能量：70 eV，温度：250 ℃，采用全扫描模式采集数据，扫描质量范围：40～600 amu。

1.4 顶空固相微萃取条件

1.4.1 取样量 分别精密称取桂枝-白芍药对混合粉（质量比为1∶1）0.40、0.60、0.80、1.00 g，在60 ℃下平衡10 min，选用65 μm PDMS/DVB 萃取纤维头萃取15 min，进针后解析3 min，按GC-MS 的条件进样测定，以色谱出峰总面积为主要指标，以质谱鉴定出的化合物种类数为辅助指标，对样品取样量进行优化，确定最佳取样量为0.60 g。

1.4.2 萃取温度 精密称取桂枝-白芍药对混合粉0.60 g，其他条件不变，分别在40、60、80、100、120 ℃条件下对混合样品进行萃取，按GC-MS 的条件进样测定和分析，确定最佳萃取温度为60 ℃。

1.4.3 萃取时间 精密称取桂枝-白芍药对混合粉0.60 g，在60 ℃下加热平衡10 min，其他条件不变，选用65 μm PDMS/DVB 萃取纤维头分别萃取10、15、20、25、30 min，按GC-MS 的条件进样测定和分析，确定最佳萃取时间为15 min。

1.4.4 解析时间 精密称取桂枝-白芍药对混合粉0.60 g，在60 ℃下加热平衡10 min，选用65 μm PDMS/DVB 萃取纤维头萃取25 min，取出，立即插入色谱仪进样口，分别解析1、2、3、4、5 min，按GC-MS 的条件进样测定和分析，确定最佳解析时间为3 min。

综合单因素考察［9］结果，确定最佳的萃取条件：取样量0.60 g，萃取温度60 ℃，萃取时间15 min，解析时间3 min。单味药与桂枝-白芍药对的试验条件一致。

1.5 数据处理

采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量，并运用Mainlib 谱库对所出峰的质谱图进行检索，以鉴定各组分。使用SPSS 26.0 软件对桂枝、白芍及其药对的挥发性成分进行主成分分析（PCA）。

2 结果与分析

依照上述条件通过HS-SPME-GC-MS 联用法分析桂枝、白芍及其药对的挥发性成分，通过气相质谱联用仪得到总离子流图（图1、图2、图3）。用峰面积归一化法计算各组分的相对含量，并运用Mainlib谱库对所出峰的质谱图进行检索，初步鉴别出87 个成分，具体信息见表1。

表1 桂枝、白芍及其药对的挥发性成分

图1 桂枝的总离子流

图2 白芍的总离子流

图3 桂枝-白芍药对的总离子流

2.1 桂枝、白芍及其药对的定量分析

由图1、图2、图3、表1 可知，桂枝出峰83 个，鉴定出47 个成分，相对含量为96.91%；白芍出峰86个，鉴定出49 个成分，相对含量为90.58%；桂枝-白芍药对出峰81 个，鉴定出54 个成分，相对含量为94.57%。

桂枝的总挥发性成分中相对含量最高的是反式-肉桂醛（37.23%），其次是α-依兰油烯（7.43%）、邻甲氧基肉桂醛（7.14%）、α-蒎烯（7.00%）等。白芍总挥发性成分中相对含量最高的是γ-马榄烯（17.23%），其次是α-姜黄烯（10.76%）、β-石竹烯（9.05%）、丹皮酚（7.82%）等。桂枝-白芍药对总挥发性成分中相对含量最高的是反式-肉桂醛（21.33%），其次是邻甲氧基肉桂醛（6.92%）、α-雪松烯（6.79%）、肉桂醛（5.35%）等。

2.2 桂枝、白芍及其药对的挥发性成分种类和相对含量分析

从桂枝、白芍及其药对中鉴别出的化学成分可以分为醛类、酯类、烯类、酮类、醚类、酚类、醇类、酸类，具体信息见表2。桂枝、白芍及其药对中均是烯类成分最多。桂枝中醛类、烯类的相对含量较高，分别为48.52%、44.62%；白芍中烯类的相对含量最高，分别为71.72%；桂枝-白芍药对中醛类、烯类的相对含量较高，分别为41.10%、44.22%。

表2 桂枝、白芍及其药对挥发性成分数量和相对含量

2.3 桂枝、白芍及其药对共有成分和特有成分分析

桂枝、白芍及其药对有13 个共有成分，包括δ-榄香烯、β-石竹烯、γ-依兰油烯、α-姜黄烯等，且相对含量有所差异。桂枝-白芍药对和桂枝有38 个共有成分，包括反式-肉桂醛、肉桂醛、α-蒎烯等。桂枝-白芍药对和白芍有23 个共有成分，包括γ-马榄烯、伯克希哈拉德烯、α-律草烯等。桂枝-白芍药对有6 个特有成分（2.49%），包括长叶松烯（0.61%）、反式-β-金合欢烯（0.98%）、反式乙酸戊烯酯（0.28%）等。桂枝有7 个特有成分（10.32%），包括α-依兰油烯（7.43%）、去氢白菖烯（2.16%）、（+）-苜蓿烯（0.25%）等。白芍有24 个特有成分（24.33%），包括（+）-β-芹子烯（6.01%）、大根香叶烯B（2.53%）、β-倍半水芹烯（2.17%）等。

2.4 桂枝、白芍及其药对的挥发性成分PCA

由表1 可知，桂枝、白芍及其药对的挥发性成分相对含量数据离散，因此采用主成分分析把离散的数据标准化处理，对桂枝、白芍及其药对挥发性成分的相似性和差异性进行评价。采用SPSS 26.0 软件对3 组样品的87 种挥发性成分相对含量进行主成分分析（PCA）［9］。由表3 可知，前2 个主成分的初始特征值均大于1.000，前2 个主成分的累计贡献率达97.026%，可以反映样品挥发性成分相对含量的整体信息，因此选取前2 个主成分进行进一步分析，结果见表4。综合得分越高，主成分占该组总挥发性成分相对含量的比例越高。单味药与桂枝-白芍药对的综合得分有所差异，其中桂枝-白芍药对的综合得分最高，表明桂枝-白芍药对配伍后主成分相对含量更高，治疗作用更强。

表3 主成分的初始特征值、方差及累积贡献率

表4 桂枝、白芍及其药对挥发性成分主成分得分和综合得分

3 小结与讨论

本研究采用HS-SPME-GC-MS 联用法对桂枝、白芍及其药对配伍前后的挥发性成分进行对比分析，分别鉴定出47、49、54 个挥发性成分，相对含量分别为96.91%、90.58%、94.57%。桂枝-白芍药对和桂枝有38 个共有成分，桂枝-白芍药对和白芍有23个共有成分，桂枝-白芍药对有6 个特有成分，桂枝-白芍药对的大部挥发性成分来源于桂枝。

桂枝-白芍药对中有6 个新增的挥发性成分，分别是反式乙酸戊烯酯、反式-β-金合欢烯、长叶松烯、3-异丙基-4a，5-二甲基-1，2，3，4，4a，5，6，7-八氢萘-1-醇、4（15），5，10（14）-大根香叶三烯-1-醇、石竹-4（12），8（13）-二烯-5β-醇；单味药有33 个成分未在桂枝-白芍药对中检出，包括α-依兰油烯、（+）-苜蓿烯、β-倍半水芹烯等。桂枝-白芍药对中有16 种来源于单味药，其挥发性成分的相对含量有一定上升，如反式-α-没药烯、桉油烯醇、愈创兰油烃、（4E）-1-甲基-4-（6-甲基庚-5-烯-2-亚基）环己烯等，桂枝挥发性成分中相对含量较高的反式-肉桂醛、邻甲氧基肉桂醛、α-蒎烯等在桂枝-白芍药对中相对含量均有明显下降，白芍挥发性成分中相对含量较高的γ-马榄烯、α-姜黄烯、β-石竹烯等在桂枝-白芍药对中相对含量也有所下降。桂枝-白芍药对中相对含量增加的桉油烯醇具有抗炎、镇痛的作用［10］，愈创兰油烃有抗菌、消肿、镇痛作用［11］，桂枝-白芍药对中新增加的成分药理作用研究较少。反式-肉桂醛是桂枝镇静、镇痛、通血脉作用的主要成分之一，桂枝生品辛散能力强［12-14］，配伍后，反式-肉桂醛等主要挥发性成分相对含量的降低能够抑制桂枝过强的辛散能力。桂枝、白芍配伍前后的挥发性成分数量和相对含量都发生了较大变化，表明桂枝、白芍配伍后桂枝-白芍药对中的挥发性成分不只是单味药成分的简单相加，可能是中药的挥发性成分在高温萃取过程中发生了水解、氧化、还原、脱羧、聚合等反应，导致成分转变［15］，具体原因有待进一步探究。

顶空固相微萃取技术具有待测物质用量少、无损伤等优点，适用于分析低沸点的萜类、醛酮类和小极性的烃类化合物，常与GC-MS 联用分析中药材的挥发性成分［14，16］，与溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、超临界CO2萃取法相比具有操作简便、耗费时间短、挥发性成分损失少、成本低等优点［17-19］。本研究应用HS-SPME-GC-MS 联用法对桂枝、白芍配伍前后的挥发性成分进行检测及鉴定，对配伍前后挥发性成分的变化进行探究，为桂枝-白芍药对的配伍规律及其应用提供一定的理论依据。