白 天，崔新仪，李 宁，程伟霞，张 斌，刘敬波

（天津农学院园艺园林学院，天津 300380）

芹菜（Apium graveolensL.）属于伞形科，又称药芹或旱芹，是中国消费量巨大的蔬菜之一，在世界各地广泛栽培，资源丰富［1-3］。目前中国芹菜生产中常用的种类有本芹、西芹及西芹与本芹杂交改良型品种［4］。芹菜也可作为药用植物，其代谢网络复杂，初级代谢物和次级代谢物类型多样，且具有广泛的生物活性和药理功效。现代研究表明，芹菜富含酚类物质，主要是类黄酮和酚酸，酚类物质药理活性主要体现在抗氧化、抗炎、镇痛、降血脂、降血压等方面，芹菜叶酚类物质含量丰富，抗氧化能力显著高于基部茎与顶端茎［5-7］。

基于高效液相色谱（HPLC）的代谢组学技术对芹菜的化学成分及其质量进行定性和定量鉴别，能够对多种不同类别代谢物同时进行检测分析，不仅能够深入理解植物代谢网络与代谢调控，还能揭示植物表型与植物生长、发育及生物多样性之间的关系［8-10］。任园宇等［11］建立同时测定6 种酚酸化合物的高效液相色谱-质谱串联方法，并用于高温胁迫前后不同品种玉米幼苗酚酸类化合物含量的检测，表明酚酸化合物含量变化可能与高温胁迫的敏感性有关。He 等［12］利用高效液相色谱同时测定了桑叶中绿原酸和芦丁等化合物的含量，建立了桑叶抗氧化能力的可靠指纹图谱，并用于桑叶质量鉴定。Wei 等［13］基于代谢组学技术对甘草151 种生物活性次级代谢产物进行定量分析，首次揭示了植物次生代谢途径中的单亲遗传，对甘草和其他药用植物的生物合成、遗传和质量控制研究提供参考。Zhang等［14］利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱进行大规模非目标代谢组学分析，对不同诱导氮水平下的2 个小麦品种生长期进行代谢组学分析，证实了低氮胁迫可增加小麦次级代谢产物含量，揭示了次生代谢物积累是对非生物因素的胁迫反应。以植物代谢物为基础的组学研究有利于建立基因和代谢产物之间的完整网络关系，从代谢角度进一步全面阐明植物代谢规律及其关键途径［15-18］。

本研究基于HPLC 建立11 种酚类化合物的分析方法，进行系统的方法学考察。应用该方法获取10 种芹菜品种的酚类代谢物特征，结合聚类分析法对芹菜进行综合评价。为芹菜品种的优选和质量的规范化和标准化提供基础资料，并为芹菜内在质量的综合评价和全面控制提供新的参考方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 LC-20A 型高效液相色谱仪（PDA 检测器），岛津企业管理（中国）有限公司；HP 超声波清洗器，保定圣峰仪器科技有限公司；CAV264C 型电子天平，奥豪斯仪器有限公司；电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司。

1.1.2 标准品 芹菜素（纯度≥98%）、阿魏酸（纯度≥99.5%）、木犀草素（纯度≥98%）、山奈酚（纯度≥98%）、槲皮素（纯度≥98.5%）均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；芹菜苷（纯度≥98.9%）、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（纯度≥98.7%）均购于成都瑞芬思生物科技有限公司；儿茶素（纯度≥98%）购于天津百奥泰科技发展有限公司；绿原酸（纯度≥98%）购于天津晟佰昊生物技术有限公司；咖啡酸（纯度≥99%）购于天津索罗门生物科技有限公司；芦丁（纯度≥90.5%）购于中国食品药品检定研究院；去离子水；乙酸（色谱纯）、甲醇（色谱纯）均购于天津市康科德科技有限公司；无水乙醇（分析纯）购于天津百奥泰科技发展有限公司。

1.2 标准工作液的配制

分别用色谱级甲醇将芹菜素、阿魏酸、木犀草素、山奈酚、槲皮素、芹菜苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、芦丁11 种酚类标准品溶解，定容得到0.1 mg/mL 的标准储备液，再用甲醇将上述储备液稀释成试验所需的不同质量浓度梯度标准工作液，于4 ℃冰箱避光保存。

1.3 样品前处理

精准称取新鲜芹菜叶片0.5 g，置于50 mL 离心管内，用乙醇水（体积比为70∶30）溶液10 mL 均质，在60 ℃下超声波提取1 h，10 000 r/min 离心5 min，取上清液稀释10 倍，0.22 μm 的微孔滤膜过滤后，样品进行色谱分析。

1.4 色谱条件

色谱柱：Venusil XBP Cl8（L）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A：0.2%乙酸溶液（pH 3.0）；流动相B：甲醇；梯度洗脱程序：（0～10 min，20%～50% B；10～25 min，50%～50% B；25～35 min，50%～90% B；35～45 min，90%～20% B）；流速：0.5 mL/min；进样量：20 μL；检测波长：240 nm。

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

采用PDA 检测器在波长190～800 nm 范围内对11 种酚类化合物进行全波长扫描，发现多数化合物的最大吸收波长为240～290 nm，而波长240 nm 下各化合物均有较强的紫外吸收峰，认为该波长可以兼顾各组分的检测，因此选择240 nm 为检测波长。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择 选择合适的色谱柱是分析方法的关键。C18 色谱柱是实验室经常使用的色谱柱，因此本研究优先选择C18 色谱柱。但是即使同样是C18 色谱填料，因为键合技术、硅羟基封尾基团的不同，色谱柱的选择性也有很大的差别。在色谱条件相同的情况下，比较了Venusil XBP Cl8（L）（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）3 种色谱柱对11 种酚类化合物的分离效果。结果表明，在相同的梯度洗脱下，Agilent TCC18 柱对槲皮素、木犀草素、山奈酚和芹菜素出现严重的拖尾，保留时间过长，分离效果不佳；Agilent Eclipse XDB-C18 柱对芦丁、芹菜苷、山奈酚、芹菜素分离度不够，并且槲皮素在该柱上保留过强；Venusil XBP Cl8（L）柱对11 种酚类化合物能很好地分离，响应值高。因此本研究选用Venusil XBP Cl8（L）色谱柱作为分离色谱柱。

2.2.2 流动相的选择 按照“1.4”项下色谱条件进行分析，对甲醇-水、甲醇-0.2%乙酸、乙腈-0.2%乙酸3 种流动相体系进行考察，在甲醇-水流动相条件下，儿茶素与杂质无法分离；乙腈-0.2%乙酸流动相条件下，11 种酚类化合物分离效果不佳。因此选择甲醇-0.2%乙酸溶液作为本研究的流动相。

2.2.3 梯度洗脱条件的优化 按照“1.4”项下色谱条件进行分析，考查了4 种梯度洗脱条件对11 种酚类化合物的分离效果，在李幼林等［19］的研究基础上，基于样品中的杂质干扰因素，将梯度洗脱时间延长，并将流动相B 浓度从40%降低至20%，另外，通过降低10～25 min 内流动相B 的浓度来达到对阿魏酸、芦丁、芹菜苷和芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的分离（表1）。结果表明，方法4 对11 种酚类化合物均获得较好的分离和检测效果，响应值高。因此，试验选用方法4 进行梯度洗脱。

表1 色谱分离流动相梯度

由图1 可知，11 种酚类化合物与其他杂质分离，各化合物的峰形良好，分离度高，因此本方法适合芹菜中11 种酚类化合物的测定。

图1 11 种酚类化合物的高效液相色谱图

2.3 标准曲线、线性范围、相关系数及检出限

配制混合标准溶液，以各分析物的峰面积（y）和相应的质量浓度（x，μg/mL）绘制标准曲线，得到线性回归方程。结果表明，各目标物在0.5～10.0 μg/mL范围内11 种酚类化合物的线性关系良好，相关系数（R2）均≥0.990（表2）。以信噪比（S/N）为3 时对应的对照品浓度作为检出限（LOD），S/N 为10 时对应的对照品浓度作为定量限（LOQ）。结果表明，11 种酚类化合物的检出限为0.07～0.29 mg/kg，定量限为0.20～0.84 mg/kg。

表2 11 种酚类化合物的回归方程、线性范围、相关系数、检出限及定量限

2.4 回收率和精密度

在测定样品前，先测定样品的本底值，添加标样样品的测定值扣除本底值的结果用于计算回收率。在0.5 g 芹菜叶样品中分别按0.2、0.4、1.0 mg/kg 3 个浓度添加混合标准溶液，每个水平平行测定3 次。由表3 可知，11 种酚类化合物的平均加标回收率为71.90%～134.00%，相对标准偏差（RSD）为0.30%～4.00%（n=3）。说明该方法具有良好的准确度和精密度，可用于芹菜酚类活性成分的检测。

表3 11 种酚类化合物的平均加标回收率和相对标准偏差

2.5 标准溶液的稳定性

取相同质量浓度的11 种酚类标准品混合溶液，室温条件下分别于第0、4、8、12、16、20、24 h 进行测定，进样量20 μL，在“1.4”项色谱条件下进行分析，计算各成分峰面积的相对标准偏差。结果表明，11种酚类化合物精密度的相对标准偏差均小于3.00%，各成分稳定性良好。

2.6 实际样品测定

采用上述方法对市场售卖的10 种芹菜样品进行测定，结果如表4 所示。在四季香芹中芹菜苷和芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量较高，分别为44.525、57.879 mg/kg；在津星西芹中绿原酸含量最高，为107.119 mg/kg；在天双西芹、四季香芹中阿魏酸含量差异明显。

表4 不同芹菜叶样品中11 种酚类化合物的含量（单位：mg/kg）

2.7 数据分析

聚类分析是将样品按照品质特性相似度逐渐聚合在一起，最终按照类别的综合性质将多个品种聚合，从而完成聚类分析的过程［20］。采用SPSS 23.0 软件，使用组间连接法进行系统聚类分析，结果见图2所示。基于次生代谢物含量的不同将芹菜样品分为3 类，第1 类为津青实芹一号、天津实心芹、金于夏芹和天双西芹，第2 类为津抗法拉利、津耘芹二号、津星西芹、玉香1 号和白翠香实芹，第3 类为四季香芹。结果表明，10 种芹菜都含有重要影响的代谢产物，酚类组分存在相似性，但存在品种间的差异。通过HPLC 结合聚类分析可为芹菜质量评价及鉴定提供依据，能够提供更多的代谢物信息，对芹菜中酚类物质的开发提供技术支撑，为研究芹菜次生代谢产物积累规律提供有效手段。

图2 基于HPLC 的芹菜样品的聚类分析

3 小结

本研究成功建立了一种同时测定芹菜中11 种酚类化合物含量的方法，该方法操作简便，灵敏度高，准确度、精密度和重现性好，为阐述芹菜的药效物质基础提供了新的思路。结合聚类分析较全面地反映了芹菜酚类活性成分的化学信息，可用于评估芹菜指标成分含量与品种之间的相关性，为营养功能成分作用机制研究提供新方法。