柯昌虎，严 慧，赵 阳，朱 军，李志浩

（1.湖北医药学院附属国药东风总医院，湖北十堰 442008；2.西安交通大学第二附属医院（西北医院），西安 710004）

人口老龄化在全世界呈不可逆的趋势，是人类正面临的一个共同难题。目前，中国65 岁及以上人口比重达13.50%［1］，即将步入中度老龄化阶段，人口老龄化程度已明显高于世界平均水平（9.3%）。衰老是生物体的结构和功能随着年龄的增长而下降的一种生理性现象，与炎症反应、应激反应、能量代谢、内分泌等有关，已成为糖尿病、癌症、心血管疾病等人类疾病的主要危险因素［2］。衰老问题是社会问题，也是重要的生物医学问题。如何有效延缓衰老进程，提高健康整体水平，应对老龄化带来的挑战，成为当下人们思考和关注的热点问题。中医药在预防保健方面优势明显，中药及复方可以有效延缓衰老，干预老年性疾病发生发展过程［3］。

黄精（PolygonatiRhizoma）始载于《名医别录》，自古以来作为养生佳品，是一味药食同源的药材，广泛用于临床配方、中成药生产以及古法九制后作为功能性食品及药膳原料等。药用黄精来源于百合科植物滇黄精、黄精或多花黄精的干燥根茎，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾的功效［4］。现代研究表明，黄精主要含有多糖类、皂苷类、黄酮类、生物碱类、植物甾醇类等化学成分［5］，具有抗衰老、抗肿瘤、降血糖、抑菌抗炎、抗氧化、提高免疫力、抗骨质疏松等多方面的药理作用［6］，临床上用于治疗动脉粥样硬化、卵巢功能减退、糖尿病并发症、原发性高血压、慢性胃炎、改善心肾及肝肾功能等。研究发现，黄精可以通过调控BDNF-TrkB 信号途径，显著上调突触可塑性相关蛋白的表达，改善自然衰老大鼠海马和皮层神经元损伤，进而改善自然衰老大鼠认知功能障碍［7］；可以通过降低ROS水平来延缓传代培养内皮祖细胞的衰老进程并保护其功能［8］；可以通过抑制ATM/ATR 通路，调节内皮祖细胞的细胞周期，干预内皮祖细胞的老化进程［9］。黄精中功能性成分多糖可以通过调节大鼠Klotho-FGF23内分泌轴、缓解氧化应激、平衡钙磷代谢发挥抗衰老作用［10］；可以通过抑制氧化应激来减轻D-半乳糖诱导的心脏衰老［11］；可以清除自由基，增加抗氧化酶活性，能够改善D-Gal模型小鼠学习记忆的能力［12］。虽然黄精具有良好的抗衰老作用，但其抗衰老的药效物质成分尚无系统报道，发挥疗效的具体机制亦不明确。本研究利用网络药理学和分子对接方法，构建黄精有效成分-靶点-衰老作用网络，探讨其抗衰老的物质基础及可能的分子作用机制，为临床治疗衰老及保健产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 黄精活性成分及作用靶点的筛选

通过检索TCMSP 数据库收集黄精的化学成分，以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（Drug-likeness，DL）≥0.18 两个指标作为筛选条件获取候选成分［13］，在PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取相关成分的SMILES 格式，未检索到的化合物通过TCMSP 数据库下载成分的mol2 格式文件，然后转化为SMILES格式文件。通过Swiss target prediction 数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）导入SMILES 文件获取成分的靶点，取Probability 大于0 的靶点。

1.2 衰老疾病相关靶点的筛选及共同靶点的获取

以“aging”为检索词，分别在GeneCards（https：//www. genecards. org/）、OMIM（https：//omim. org/）、DiGSeE（http：//210.107.182.61/geneSearch/）、HAGR（https：//genomics.senescence.info/）数据库中筛选衰老相关靶点，其中GeneCards 数据库中提取关联性评分大于10 的基因。在Venny 2.1 在线平台（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）分别录入黄精与衰老的靶点，绘制韦恩图，获取二者的共有靶点。

1.3 药物-成分-疾病-靶点网络的构建

使用Cytoscape 3.8.2 软件上传成分及靶点信息，构建“药物-成分-疾病-靶点”相互作用网络图，使用Network Analyzer 功能以节点度值（Degree）为拓扑指标进行分析。在网络中，节点分别代表药物、成分、靶点和疾病，边表示任意两者之间的互作关系。

1.4 蛋白互作网络的构建

在STRING 在线平台数据库（https：//www.stringdb.org/）中，点击Multiple proteins 上传共有靶点，设置Organism 类型为“Homo sapiens”，选择交互作用大于0.4 的靶点，下载TSV 格式数据文件，导入Cytoscape 3.8.2 软件中进行拓扑分析，构建蛋白质相互作用（Protein-protein interaction，PPI）网络可视化。

1.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析

利用DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行GO 功能与KEGG 通路富集分析，主要由以下4步进行。第一步，上传黄精的有效作用靶点；第二步，Select Identifier 设置为“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，并限定物种为“Homo Sapiens”；第三步，List Type 设置为“Gene List”；第四步，提交数据获取结果。以P＜0.01 为阈值进行筛选，探讨黄精抗衰老的生物学过程和信号通路。

1.6 分子对接验证

从PubChem 数据库下载活性成分2D 结构的sdf文件，使用Open Babel 软件将其转化为mol2 格式。从PDB 数据库（http：//www.rcsb.org/）中获得蛋白受体的3D 结构，运用PyMOL 软件对蛋白去水、去除蛋白结构中小分子配体，保存pdb 文件格式。使用AutoDock 工具将蛋白和活性成分进行分子对接，再使用PyMOL 软件对成分-蛋白对接结果进行可视化分析。结合自由能小于0，则表明药物成分的分子和配体受体可以自发结合，结合打分值越低则形成的复合物越稳定。

2 结果与分析

2.1 黄精主要活性成分及作用靶点

检索TCMSP 数据库得到黄精的化学成分114个，以OB≥30%和DL≥0.18 作为指标共筛选出活性成分12 个，结果见表1。将各个成分的SMILES 格式导入Swiss target prediction 数据中查找成分靶点，取Probability 大于0，合并去重共得到318 个靶点。

续表1

2.2 疾病靶点的检索及药物-疾病共有靶点的筛选

使用GeneCards、OMIM、DiGSeE、HAGR 数据库筛选衰老靶点，合并去重后共获得506 个靶点。使用Venny 在线工具对黄精靶点和衰老靶点进行交集分析，绘制出韦恩图，如图1 所示，二者取匹配后得到黄精和衰老共有靶点81 个。

图1 黄精和衰老的靶点韦恩图

2.3 药物-成分-靶点-疾病网络构建

将黄精活性成分与共有靶点等信息输入到Cytoscape 3.8.2 软件中，绘制“药物-成分-靶点-疾病”相互作用的网络，如图2 所示。共有95 个节点、302条边，图中黄色六边形代表黄精，绿色正方形代表中药的核心成分，蓝色圆形代表靶点，红色菱形代表疾病。对网络图进行拓扑分析，degree平均值为6.357 9，其中degree 排名前5 位的成分是黄芩素（degree=31）、4′，5-二羟基黄酮（degree=30）、甘草素（degree=28）、（2R）-7-羟基-2-（4-羟基苯基）-苯并四氢吡喃-4-酮（degree=28）、zhonghualiaoine 1（degree=25），可能是黄精抗衰老的关键活性成分。

2.4 蛋白相互作用网络构建

在STRING 数据库中录入黄精和衰老共有靶点，选取置信度＞0.4 的网络数据，得到黄精抗衰老的靶点蛋白相互作用信息数据，导入Cytoscape 3.8.2 软件中进行PPI可视化分析，网络中共有81 个节点，共有910 条边，degree 平均值为22.469 1，大于平均值靶点的有34 个，结果如图3 所示。Degree 排名前5位的靶点是EGFR（degree=60）、VEGFA（degree=57）、HIF1A（degree=51）、ESR1（degree=51）、STAT3（degree=51），其可能在抗衰老中发挥重要调控作用。

2.5 GO 功能富集分析结果

利用DAVID 数据库对筛选的基因进行GO 功能富集分析（P＜0.01），结果共有227 条生物学过程，其中生物过程（BP）164 条，主要涉及蛋白质自磷酸化、细胞增殖的正调控、基因表达的正调控、凋亡过程的负调控、蛋白质磷酸化等；细胞组分表达过程（CC）25 条，主要涉及核质、胞浆、受体复合物、小窝、线粒体等；分子功能相关的过程（MF）38 条，主要涉及酶结合、ATP 结合、蛋白酪氨酸激酶活性、激酶活性、蛋白质结合等。分别选取BP、CC、MF 的前10 个条目进行气泡图展示，结果见图4，其中横轴为富集因子，纵轴为GO 功能名称，表明黄精可以通过参与调控多种生物学过程而发挥抗衰老作用。

图4 黄精抗衰老的GO 功能富集分析

2.6 KEGG 通路富集分析结果

对筛选的基因进行KEGG 通路富集分析（P＜0.01），共获得79 条信号通路，主要涉及癌症途径（30个靶点）、癌症中的蛋白多糖（21 个靶点）、HIF-1 信号通路（15 个靶点）、Ras 信号通路（20 个靶点）、癌症的中枢碳代谢（13 个靶点）、PI3K-Akt 信号通路（23个靶点）、FoxO 信号通路（16 个靶点）、Rap1 信号通路（18 个靶点）、催乳素信号通路（12 个靶点）、ErbB信号通路（12 个靶点）、胰岛素信号通路（14 个靶点）等。选择前20 条进行气泡图展示，结果如图5 所示，其中横轴为富集因子，纵轴为通路名称，表明黄精的有效成分和抗衰老靶点可能分布于不同的通路中，可通过多种通路达到抗衰老的作用。

图5 黄精抗衰老的KEGG 通路富集分析

2.7 分子对接结果

从PDB 数据库中筛选受体EGFR、VEGFA、HIF1A、ESR1、STAT3 的蛋白三维结构，将其分别与配体黄芩素（C4）、4′，5 -二羟基黄酮（C1）、甘草素（C2）、（2R）-7-羟基-2-（4-羟基苯基）-苯并四氢吡喃-4-酮（C3）、zhonghualiaoine 1（C11）在AutoDock中进行分子对接，结合能小于-20.93 kJ/mol 表示可以形成稳定的对接结构［14］，5 个活性成分与5 个靶点之间均能产生稳定的结合，对接结合能见图6。受体ESR1 与配体的结合能均小于-20.93 kJ/mol，使用PyMOL 软件进行可视化分析，结果显示，ESR1 与C4通过氨基酸残基ALA318、ASP321、ARG363 产生6个氢键作用，与C1 通过氨基酸残基GLY521、LEU387 产生2 个氢键作用，与C2 通过氨基酸残基GLU353、ARG394 产生2 个氢键作用，与C3 通过氨基酸残基GLY521 产生1 个氢键作用，与C11 通过氨基酸残基HIS305 产生3 个氢键作用（图7）。

图6 对接结合能热图

图7 分子对接图

3 小结与讨论

衰老是生理功能不可逆转地逐渐衰退，表现出抵抗感染的能力下降、对疫苗的反应减弱、癌症发病率增加、自身免疫和结构性低度炎症的发病率升高等，会引起各种癌症、心血管疾病、代谢性疾病等诸多与年龄相关的疾病，从而给家庭和整个社会带来了沉重的心理和经济负担［15］。因此，寻找抗衰老药物对延缓生理性衰老和治疗衰老相关疾病都至关重要。中医药干预衰老以整体观念、辨证论治为特点，在延缓衰老方面作用明显。《抱朴子》中记载黄精“得坤土之气，获天地之精”，被美誉为“仙人余粮”，《本草纲目》称黄精“补诸虚、填精髓，平补气血而润”。黄精对肺、脾、肾都能补益，药用食用均可以防衰延年。现代药理研究也表明黄精具有良好的延缓衰老等药理作用，但其化学成分复杂，治疗衰老分子机制尚未明确，本研究采用网络药理学对黄精治疗衰老的机制进行分析，并利用分子对接技术进行验证。

以生物利用度和类药性为考察指标，从黄精中筛选出黄芩素、4′，5-二羟基黄酮、甘草素、（2R）-7-羟基-2-（4-羟基苯基）-苯并四氢吡喃-4-酮、zhonghualiaoine 1 等活性成分。其中，黄芩素属于黄酮类活性成分，能够有效清除自由基，起到抗氧化剂作用，并应用于治疗与氧化应激相关的多种疾病，可以通过降低果蝇体内活性氧、丙二醛、氧化型谷胱甘肽等3 种物质的含量，减轻氧化应激水平，从而延长果蝇寿命［16］；可以通过调控氨基酸代谢、核苷酸代谢和糖代谢等途径延缓大鼠衰老［17］；可以提高衰老大鼠心肌抗氧化能力，抑制其下游p53/p21Cip1/Waf1信号通路，延缓成年SD 大鼠的心肌衰老［18］；可以显著抑制SAMP8 小鼠大脑皮层中IL-6、IL-1β、TNF-α 等促炎细胞因子的释放，明显改变6 个菌属的丰度，通过抑制皮层促炎细胞因子和调节肠道菌群，改善小鼠的衰老状态和认知功能［19］；可以通过抑制SASP，抑制JAK2/STAT1/NF-κB 通路和调节亮氨酸代谢，在H2O2诱导的衰老星形胶质细胞中发挥保护和抗衰老作用［20］。甘草素属于双氢黄酮类成分，具有抗炎、抗氧化以及神经保护作用，能够改善学习记忆功能，有助于延缓衰老。生物体内自由基过量累积会加速机体老化，甘草素可以通过抽氢反应捕获体内·OH、·OOH 和·OOCl3C 3 种活性氧自由基，发挥清除自由基作用［21］。甘草素还具有雌激素样作用，通过上调ERβ 水平，对抗Aβ 毒副作用，可以消除去卵巢APP/PS1 双转基因小鼠脑内老年斑［22］。

经黄精和衰老共有靶点交集筛选出EGFR、VEGFA、HIF1A、ESR1、STAT3 等靶点。其中表皮生长因子（EGF）是EGFR 最重要的配体之一，影响细胞的增殖、分化等过程，以EGF 激活EGFR 能够诱导细胞衰老［23］。血管内皮生长因子（VEGF）参与血管生成，在控制血管通透性、维持心血管活性及微血管密度等方面发挥重要的作用。通过基因手段保持循环中的VEGF 水平能够维持衰老过程中的血管稳态，提供全面的衰老保护，减轻各种年龄相关疾病，例如年龄相关的体重增加、肝脂肪变性、骨质疏松、炎症和肿瘤。提升小鼠体内VEGF 水平，能够显著延长小鼠寿命，雄性小鼠延寿48%、雌性小鼠延寿39%［24］。缺氧诱导因子1A（HIF1A/HIF1α）信号在急性缺氧应激中，对维持细胞存活具有非常重要的意义。长期慢性的缺氧以及病理性应激条件下，HIF-1α 信号会通过诱导组蛋白赖氨酸去甲基化酶来破坏染色质的稳定性，从而引起细胞衰老和组织纤维化。同时，细胞衰老提供的炎性微环境又会进一步刺激HIF-1α 诱导的组蛋白赖氨酸去甲基化酶的表达，从而陷入一个恶性循环［25］。雌激素受体α（ESRα）参与衰老过程中的生物过程，有助于维持心血管、代谢、认知、下丘脑和边缘功能等生物功能，ERα 基因（ESR1）的DNA 甲基化变化在调节ERα 水平中起直接作用，老年女性E2 水平下降与ESR1 基因CpGI 低甲基化的降低有关［26］。信号转导与转录激活子3（STAT3）作为JAK/STATs 通路的重要成员，广泛参与免疫调节、衰老等过程。研究发现，STAT3通路及自噬激活参与血管紧张素II诱导的小鼠肾小管上皮细胞衰老过程，氯沙坦作用可抑制STAT3 的激活、抑制自噬过度激活并延缓小鼠肾小管上皮细胞衰老［27］。

经GO 功能分析获取蛋白质自磷酸化、细胞增殖的正调控、基因表达的正调控等生物学过程。经KEGG 通路分析获取癌症途径、癌症中的蛋白多糖、HIF-1、Ras、癌症的中枢碳代谢、PI3K-Akt、FoxO、Rap1 等信号通路。其中，HIF-1 在机体对低氧浓度或缺氧应答中至关重要，能够激活多种靶基因的转录，调控生长发育、生理应激及病理状态过程，可以通过发挥抗衰老功能，延长maa-1 缺陷蠕虫的寿命［28］。Ras 通过下游通路激活p53 从而诱导衰老，通过非依赖p53 的途径产生OIS，同时可以通过失活C/EBPβ 逃逸衰老，K-Ras 也可以通过抑制p53 的活性逃逸衰老［29］。PI3K-Akt 信号通路参与调节细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等过程，激活PI3K-Akt 通路可以促进细胞系的生长和增殖，同时AKT 表达水平的升高可以保护细胞对抗衰老和凋亡。研究发现，胰岛素样生长因子1（IGF-1）经PI3K-Akt 通路调控2 型糖尿病患者骨髓间充质干细胞衰老及成骨分化［30］；外源性硫化氢可以激活PI3K/Akt/eNOS 信号通路，改善H2O2诱导的内皮细胞衰老［31］。哺乳动物的FoxO 家族包括FoxO1、FoxO3a、FoxO4 和FoxO6，其中FoxO1 参与调节细胞增殖、细胞内氧化应激机体能量代谢及众多生物学过程，miR-96-5p 可通过负调控FoxO1 调节成骨细胞的衰老、凋亡和成骨分化，从而影响成骨细胞的衰老过程［32］。FoxO3a 变异与许多种群的寿命有关，在皮肤角质形成细胞及成纤维细胞中均可表达，是PI3K/AKT 通路的关键靶点，PI3K/Akt/FoxO3a 通路激活可以逆转TNF-α 引起的GNRH1 基因抑制和NF-κB 激活，有助于防止衰老相关的下丘脑GnRH 释放减少［33］。FoxO4 是胰岛素/胰岛素样生长因子信号通路的靶点和活性氧的调节因子，与细胞衰老和组织稳态密切相关。靶向抑制FoxO4 的表达可有效延缓人脐带间充质干细胞的衰老［34］。调控蛋白Rap1 与衰老密切相关，Rap1缺陷会加剧端粒磨损，通过激活p53，从而抑制PPARα 的表达，小鼠心脏出现衰老相关表型以及脂肪酸代谢降低，Rap1/p53/PPARα 信号可能是预防/减轻心脏衰老的治疗靶点［35］。在低剂量化疗药物诱导的胃癌细胞衰老过程中，可见Rap1 表达升高，且促进了SASP 相关因子的表达［36］。最后，通过AutoDock 分子对接发现黄芩素、4′，5-二羟基黄酮、甘草素、（2R）-7-羟基-2-（4-羟基苯基）-苯并四氢吡喃-4-酮、zhonghualiaoine 1 等成分与EGFR、VEGFA、HIF1A、ESR1、STAT3 等靶点相互作用，表明黄精具有抗衰老的功效。

综上所述，本研究通过网络药理学联合分子对接的方法对黄精抗衰老的物质基础和作用机制进行探索，从分子水平对其作用机制进行系统分析，黄精中黄芩素、4′，5-二羟基黄酮、甘草素等活性成分可以通过多靶点、多途径抗衰老，从而为其分子机制的深入研究、临床应用以及保健产品开发研究提供思路。