广西百色西番莲茎基腐病病原菌分离与鉴定

2023-11-07杨翠凤余爵运林有林

湖北农业科学 2023年10期

杨翠凤，滕峥，余爵运，林有林

（1.百色学院农业与食品工程学院，广西百色 533000；2.百色市玉米研究所，广西百色 533604）

西番莲（Passiflora coeruleaL.）为西番莲科（Passifloraceae）西番莲属（Passiflora）多年生常绿攀缘性藤本果树，因其果汁可散发出多种水果的香味，又名百香果［1］。西番莲产业经济效益显著，在广西发展迅猛，是农村农民脱贫致富和乡村振兴重点推广的经济作物。在中国南亚热带地区，西番莲被列为重点开发的作物之一，西番莲饮料还被列为中国国家级“星火”计划项目、“七五”重点科技攻关项目以及福建、广西等省份的“出口创汇”发展项目、“优果工程”的新目标［2，3］。研究表明，引起植物的茎基腐病主要病原菌为镰孢属（FusariumLink ex Fr.）、腐霉属（Pythium）两大类。茎基腐病的最初侵染源主要分布在病土以及植物病残体内越冬的卵孢子、田间土壤、带菌的种子和植物病残体。对病原侵染组织后的植株细胞结构进行观察，发现镰孢菌主要分布在植物的韧皮部，而腐霉菌主要分布在植物的导管［4］。茎基腐病对小麦、番茄、玉米等作物均有着极其严重的危害［5-9］。茎基腐病是西番莲生产上主要病害之一，严重影响着西番莲种植业的发展，尤其是在炎热多雨高湿的季节，气候条件对西番莲茎基腐病病原菌的传播及繁殖极其有利，引起西番莲茎基腐病病害的急剧加重。林寿峰等［10］、李德福等［11，12］对病原物进行分离培养、镜检及致病性测定表明，导致福建省西番莲茎基腐病的病原菌为茄腐皮镰刀菌（Fusarium solani），有性世代为红球丝赤壳菌（Netria haematoccoca），引起广东西番莲茎基腐病的病原菌也鉴定为腐皮镰孢菌［Fusarium solani（Mart）Sacc］［13］，这些研究结果与巴西［14，15］、哥伦比亚地区［16］检测结果一致。而郑加协等［17］、黄盈等［18］通过对病原物分离培养、形态特征观察与致病性测定等试验，发现另一种引起西番莲茎基腐病发病的致病菌——镰孢属美丽组（Section Elegans Wr.）的尖镰孢菌（Fusarium oxysporumSchlecht）。陈星［19］研究结果表明引起广西防城港西番莲茎基腐病发病的致病菌为尖孢镰刀菌（Fusarium axysporum），研究结果与巴西少部分地区检测结果［20，21］一致。詹儒林等［22］采用常规鉴定法对海南琼海西番莲茎基腐病病原菌进行鉴定，根据形态特征和最适生长温度将病原菌鉴定为烟草疫霉菌。可见，引起西番莲茎基腐病的致病菌可能有多种，本研究拟明确广西百色市百香果茎基腐病的主要致病菌，以期为进一步对西番莲茎基腐病有效防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材试材为百色市石山地区西番莲茎基腐病发病初期茎段，采样时间及地点分别为2018 年凌云县逻楼镇、2018 年平果市太平镇、2020 年田阳区坡洪镇。

1.1.2 试剂主要试剂：75%乙醇溶液、0.1% HgCl2溶液、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基、琼脂粉、丙三醇、工业乙醇等。其中，马铃薯葡萄糖琼脂培养基配方：马铃薯200 g、琼脂粉20 g、葡萄糖20 g、无菌水1 000 mL。

1.1.3 仪器主要仪器设备：超净工作台、立式压力蒸汽灭菌锅、隔水式电热恒温培养箱、电子天平、摇床、光学显微镜等。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离、培养及纯化采用组织块分离法进行病原真菌的分离。于无菌超净工作台内，用提前准备的灭菌剪刀将西番莲病害部位剪切为0.5 cm 大小的组织块，剪切的组织块需用75%乙醇溶液进行30 s灭菌，用无菌水漂洗3 次，再用0.1%升汞进行2 min 的消毒，无菌水漂洗3 次，将组织块直接接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，每个培养基接种3～5 块组织块，移至无菌培养室内，置于28 ℃隔水式电热恒温培养箱培养，定时观察菌落生长情况并进行详细记录。采用三点接种法对目标菌株进行纯化培养。分别采用试管斜面贮藏法和甘油贮藏法对菌株进行短期和长期保存。

1.2.2 菌株鉴定

1）形态学观察：观察目标菌株菌落颜色、边缘生长情况、菌丝形状等，挑取菌丝于载玻片上制成临时装片，使用光学显微镜观察孢子形态、大小，初步确定所分离病菌所属种类。

2）致病性测定：采用科赫法则进行病原物致病性测定，于超净工作台上接种百香果茎基腐病病原菌菌悬液，接种的液体培养基菌悬液移至摇床培养8 h（温度28 ℃、转速180 r/min），然后用血球计数板计数，制备成1.0×108个孢子/mL 悬浮液。用解剖针分别将百香果离体茎段和幼苗基部表皮刺伤5～8针，然后将制备的孢子悬浮液均匀涂抹患处，接种后定期观察发病情况，并从病斑组织上再次分离病原物。

3）菌株rDNA-ITS 序列测定：采用小批量DNA提取试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）提取菌株基因组总DNA。利用通用引物ITS1：5′-TAT AGCATT CCCCGTTTA-3′，ITS4：5′-TCCTAA TAA ACCAATTGC-3′进行PCR扩增。PCR反应体系为50 μL：2×TaqMasterMix 25 μL、上游引物和下游引物各2 μL，DNA 模板4 μL、ddH2O 17 μL。PCR 反应程序：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1.5 min，共35 个循环，最后72 ℃延伸5 min。PCR 产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR 产物回收纯化后连接至pMD18-T 连接载体，转入大肠杆菌DH5α 感受态细胞，挑取阳性克隆送至南宁国拓生物科技有限公司测序。

采用DNAStar对序列进行比对分析，然后在NCBI数据库进行BLAST 比对分析，利用Mega 5.05软件进行相应序列的同源性分析，并采用Neighbor-Joining（NJ）邻接法自展1 000次构建系统发育进化树。

2 结果与分析

2.1 菌株形态特征

采用组织块分离法进行西番莲茎基腐病病原真菌的分离，经分离纯化后得到6 株菌株，其中从平果市太平镇紫香1 号西番莲茎基腐病植株中分离到2株真菌，编号为ZB1、ZC1，从凌云县逻楼镇紫香1 号西番莲茎基腐病植株中分离到2 株真菌，编号为Y1-1、Y4-2，从田阳区坡洪镇台农1 号西番莲茎基腐病植株中分离到2 株真菌，编号为BS-3、BS-4。6株菌株菌落呈均匀或绵絮状，多为白色或灰白色，气生菌丝茂盛至十分茂盛，稠密或蓬松，边缘明显。其中ZB1 和BS-3 的菌落特征与霉菌菌落特征最为相似，ZC1、Y1-1、Y4-2、BS-4 与镰刀菌菌落特征相似，具体如图1 和表1 所示。

表1 菌株形态特征

图1 菌株菌落形态

2.2 接种后发病部位特征

“2.1”菌株的离体接种致病力鉴定中以BS-4 菌株的致病力最强，接种BS-4 菌株后45 d 观察的台农1 号西番莲植株形态如图2 所示。具体表现：发病部位为距离地面约10 cm 的植株根部，初期症状表现为水渍状暗褐色病斑，一段时间后病斑部位凹陷呈海绵状腐烂，随着腐烂症状加深，植株皮层腐烂脱落，显露出茎段内木质部，病害部位表皮覆盖有粉红色病原物，伴随着根部的腐烂，叶片逐渐枯萎，果实逐渐萎缩干瘪，直至整株死亡。

图2 西番莲茎基腐病发病症状

2.3 菌株ITS 序列测定

通过测定rDNA-ITS 序列对菌株进行分子鉴定，结果（图3、表2）表明，从田阳区坡洪镇台农1 号西番莲茎基腐病分离到的BS-4 菌株与尖孢镰刀菌的亲缘关系最近，同源性达98%；从凌云县逻楼镇紫香1 号西番莲茎基腐病分离到的Y1-1 菌株与串珠镰刀菌（Fusarium proliferatum）的亲缘关系最近，同源性为100%；从平果市太平镇紫香1 号西番莲茎基腐病分离到的ZB1 菌株与焦腐病菌（Lasiodiplodia theobromae）的亲缘关系最近，同源性为100%；从田阳区坡洪镇台农1 号西番莲茎基腐病分离到的BS-3 菌株与烟草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）的亲缘关系最近，同源性为99%；而ZC1 与Y4-2 菌株尚未鉴定到种，有待进一步研究和验证。

表2 菌株分子鉴定结果

图3 基于菌株rDNA-ITS 序列构建的系统发育树

3 讨论

镰孢菌属真菌是常见的病原真菌，常引起植株茎腐、根腐、枯萎等，其作为茎基腐病的病原在很多作物的研究中已得到证实，如腐皮镰刀菌为甘薯茎基腐病的主要致病菌［23］，此次研究从广西百色市西番莲茎基腐病病株中分离得到6 株病原真菌，有4 株被鉴定为镰刀菌属，说明镰刀菌是西番莲茎基腐病的主要致病菌。腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌、烟草疫霉菌已被鉴定为西番莲茎基腐病的病原菌，引起福建省西番莲茎基腐病的致病菌有腐皮镰刀菌和尖孢镰刀菌［11，12］，导致广东省西番莲茎基腐病的致病菌为腐皮镰刀菌［13］，引起广西防城港市西番莲茎基腐病的致病菌为尖孢镰刀菌［19］，本研究在广西百色市同样分离得到尖孢镰刀菌，与广西防城港市分离得到的结果一致，推测引起广西西番莲茎基腐病的优势致病菌为尖孢镰刀菌。

通过对西番莲茎基腐病症状观察发现，西番莲发病部位出现腐烂现象，结合邱金忠［24］研究报道中指出霉腐菌也为西番莲茎基腐病混合致病菌，本研究采集的西番莲茎基腐病病害样本中分离得到烟草疫霉菌、焦腐病菌，证实霉腐菌为引起西番莲茎基腐病病害的混合致病菌之一。此外，本研究从西番莲茎基腐病发病部位还分离获得了除常见病原菌之外的焦腐病菌、串珠镰刀菌，以上研究结果对西番莲茎基腐病的有效防治与生产实践具有重要的理论指导意义。