◎ 张 翠，傅 鹏，林晶洁

（国检（青岛）检测技术有限公司，山东 青岛 266109）

2020 版《中华人民共和国药典》一部明确了阿胶为马科动物驴（Equus asinusL.）的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶[1]，具有补血滋阴、润燥、止血的功效。然而近年来由于供不应求，市场上出现了很多用牛皮或猪皮掺假的阿胶，影响阿胶产品的功效和品质，损害大众利益。为此，许多研究人员对阿胶的鉴别方法进行了研究，如氨基酸分析法[2]、超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法结合主成分分析法[3]、18O 标记联合高效液相色谱-高分辨率质谱法[4]、超高效液相色谱-三重四极杆质谱法[5-6]等，其中高效液相色谱-质谱联用法操作简便、快速，且灵敏度高。因此，参考《中华人民共和国药典》中的方法对阿胶进行酶解，采用高效液相色谱-质谱联用法对阿胶、牛皮胶和猪皮胶3 种胶进行鉴别，建立了鉴别阿胶的方法，为阿胶产品品质的监控提供有效依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

阿胶标准品购自中国食品药品检定研究院；猪皮胶为自制；牛皮胶、阿胶样品、阿胶枣样品和阿胶糕样品均购自市场；测序级胰蛋白酶购自SIGMA，加50 mmol·L-1乙酸溶液溶解，于-20 ℃冷冻保存，有效期1 年；甲酸、乙酸铵、甲醇均为色谱纯；碳酸氢铵为分析纯。

LC-MS/MS 1290-6460 高效液相色谱-质谱联用仪，安捷伦公司。

1.2 方法

1.2.1 仪器条件

（1）色谱条件。色谱柱：C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.9 μm）；进样量：5 μL；流速：0.4 mL·min-1；柱温：35 ℃；流动相：A 为0.1%甲酸水+5 mmol·L-1乙酸铵水溶液，B 为甲醇。流动相梯度洗脱比例见表1。

表1 流动相梯度洗脱比例表

（2）质谱条件。离子源：电喷雾离子源（Electron Spray Ionization，ESI）；电离模式：正离子模式；扫描模式：多反应监测扫描（Multi Reaction Monitoring，MRM）；干燥气温度：350 ℃；干燥器流量：10 L·min-1；雾化气压力：40 psi；毛细管电压：3 500 V；喷嘴电压：500 V。分别将每种动物胶的酶解液注入仪器，在Q1全扫描模式下选出响应较高的母离子；再采用子离子模式，通过改变碰撞能量，扫描子离子。然后将全扫描模式下找到的母离子和子离子模式下找到的响应较高的碎片离子质荷比数据确定为 MRM 扫描模式所需的离子对，详见表2。

表2 阿胶、牛皮胶和猪皮胶的特征离子对表

1.2.2 前处理过程

取粉碎样品0.02 g，置于10 mL 容量瓶中，加入1%碳酸氢铵溶液（pH 值在7～9）8 mL，超声30 min，加入1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm水相滤膜。取滤液100 μL于进样瓶内衬管中，加入10 μL胰蛋白酶溶液后摇匀，于37 ℃恒温酶解12 h 后，注入LC-MS/MS 测定。

2 结果与分析

2.1 阿胶、牛皮胶和猪皮胶的特征离子对

分别取阿胶标准品、牛皮胶和猪皮胶经前处理得到的酶解液进行检测。由图1 可知，阿胶标准品酶解液只在阿胶特征离子对（m/z539.8 →612.4）出峰；牛皮胶酶解液只在牛皮胶特征离子对（m/z641.3 →783.3）出峰；猪皮胶酶解液只在猪皮胶特征离子对（m/z505.8 →544.3）出峰。3 种胶的特征离子对出峰时间各不相同，互不干扰。

图1 3 种胶酶解液的质谱色谱图

2.2 掺杂模型的建立

为进一步验证阿胶、牛皮胶和猪皮胶特征肽的专属性，分别建立了二元和三元掺杂模型。

2.2.1 二元掺杂模型

将阿胶与牛皮胶混合，比例分别为1 ∶1、1 ∶2，分别按1.2.2 前处理步骤酶解后得到二元掺杂模型的酶解液，注入LC-MS/MS 测定。由表3 可看出，驴皮阿胶与牛皮胶的掺杂模型均检测出牛皮胶和阿胶特征离子对。掺杂模型中阿胶特征离子对和牛皮胶特征离子对的响应与掺杂量呈比例关系。

表3 二元掺杂模型牛皮胶和阿胶特征离子检测结果表

2.2.2 三元掺杂模型

按阿胶、牛皮胶、猪皮胶掺杂比例为1 ∶1 ∶4，将3 种胶混合后按1.2.2 前处理步骤酶解，得到三元掺杂模型的酶解液注入LC-MS/MS 测定。结果显示，阿胶、牛皮胶、猪皮胶三元掺杂模型检测出了阿胶、牛皮胶和猪皮胶的特征离子对，出峰时间分别为1.433 min、1.338 min、1.076 min，互不干扰。

综上所述，本方法专属性良好，可用于混合胶的组成分析。

2.3 阿胶产品的检测

为验证该鉴别方法对阿胶产品的适用性，将3 种市售阿胶、阿胶枣和阿胶糕按1.2.2 前处理步骤提取、酶解后检测（阿胶枣和阿胶糕考虑其添加量适当增大称样量）。表4 结果显示，其中两种阿胶只检测出牛皮胶特征离子对，在阿胶和猪皮胶特征离子对处未出峰，可能为牛皮胶；有一款阿胶、阿胶枣和阿胶糕均只检测出阿胶特征离子对，在牛皮胶和猪皮胶特征离子对处未出峰，因此推断为真正的阿胶产品。

表4 各阿胶产品检测结果表

3 结论

本研究采用胰蛋白酶酶解阿胶、牛皮胶和猪皮胶，通过比较这3 种酶解产物特征多肽的差异识别出不同动物来源（阿胶、牛皮胶和猪皮胶）的酶解产物的特征离子对，该方法具有专属性强、灵敏度高的特点。通过建立阿胶、牛皮胶和猪皮胶掺杂模型，证明该方法可以用于混合胶的组成和鉴别分析。本研究建立的通过分析特征离子对追溯阿胶产品动物来源的方法，为阿胶产品的品质监控和鉴别提供了技术性支持。