周帅帅， 刘家言， 赵鹏宇， 杨庆林， 赵 剑 ， 伏雨欣， 吴 昊， 李 垚

（1.东北农业大学动物科学技术学院,黑龙江 哈尔滨 150030；2.河北省植物源动物保健品技术创新中心，河北 邯郸 057250；3.晨光生物科技集团股份有限公司，河北 邯郸 057250）

万寿菊在我国种植面积达上百万亩， 主要用于提取叶黄素， 提取后的万寿菊渣中槲皮万寿菊素（QG）含量丰富，被废弃造成资源浪费（郭耀东，2019）。 因此，实现万寿菊资源充分利用，明确QG功效和应用效果会产生很大的经济和社会意义。研究表明，适量QG 能显著提高肉鸡体增重，降低肉鸡的料肉比（郑旭等，2022；张毅峰等，2020）。日粮添加3.75 mg/kg QG 可以显著降低肉鸡血清甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL）含量，对血清总胆固醇（TC）和高密度脂蛋白（HDL）含量均无显著影响（张毅峰等，2020）。

目前蛋鸡生产中的主要问题是产蛋后期蛋鸡生产性能和蛋品质下降、蛋黄胆固醇含量较高、蛋黄磷脂和卵磷脂含量较低， 开发提高产蛋后期蛋鸡产蛋性能并改善蛋品质的饲料添加剂具有指导意义。而黄酮类化合物具有提高蛋鸡生产性能、改善蛋品质的作用，QG 属于黄酮类化合物， 但QG在蛋鸡生产中的应用效果鲜见报道，因此，为了探讨QG 对产蛋后期蛋鸡的产蛋性能和蛋品质的作用及机制，本试验对产蛋后期蛋鸡生产性能、蛋品质、脂质、抗氧化等相关指标进行检测，为QG 作为一种新型饲料添加剂的研究与开发提供科学的数据参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验材料 试验动物：385 日龄海赛克斯蛋鸡，购自哈尔滨益农禽业。 试验材料：槲皮万寿菊素纯度80%（HPLC），河北晨光生物科技有限公司提供，以粉剂的形式拌料添加。

1.2 试验设计 试验选用480 只385 日龄海赛克斯蛋鸡，随机分为4 组，每组6 个重复，每个重复20只鸡。对照组饲喂玉米-豆粕型基础饲粮，试验组基础饲粮额外添加0.32%、0.48%、0.64%QG， 试验期10 周， 玉米-豆粕型基础饲粮参照我国2020 年蛋鸡营养需要配制，基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）

1.3 饲养管理 试验鸡舍为3 层阶梯笼养，采用人工光照和自然光照相结合的方法， 每天光照16 h，自然通风，自由饮水、采食。每天08：00、16：00两次喂料。 每天16：00 捡蛋1 次、除粪一次。

1.4 样品采集 试验开始后分别于第4 周和第10 周记录、称重，收集鸡蛋，从每个重复中选取一只蛋鸡，进行翅静脉采血，静置4 h，3000 r/min 离心15 min 制备血清，-20 °C 保存。采血后，进行颈静脉放血处死， 解剖得到肝脏样品，-80 ℃冻存，测定前使用匀浆机制备肝脏匀浆液备用。

1.5 指标测定及方法

1.5.1 生产性能 生产性能计算公式如下：

产蛋率/%=每组产蛋数/蛋鸡数量×100；

平均日采食量=蛋鸡耗料量/天数；

平均蛋重=每组总蛋重/总蛋数；

料蛋比=采食量/平均蛋重。

1.5.2 蛋品质 （1）蛋壳强度：用蛋壳强度测定仪检测；（2）蛋壳厚度：用蛋壳厚度测定仪分别测定蛋的大头、小头、中间部分的蛋壳厚度，然后取平均值；（3）蛋白高度：用蛋形指数测定仪读出蛋白高度；（4）蛋黄颜色：将蛋黄和蛋清分离，在荧光灯下比色，统计各级的数量取其平均值；（5）哈氏单位：避开蛋白系带，用蛋白高度测定仪测量浓蛋白层3 个等距离点的蛋白高度， 求平均值并按照公式计算哈氏单位。

哈氏单位=100×lg（H-1.7×W0.37+7.6）；

式中：H 为所测鸡蛋的浓蛋白高度；W 为所测鸡蛋的蛋重。

蛋黄指数=蛋黄重/全蛋重×100。

1.5.3 抗氧化指标、肝脏脂质、血清激素、血清细胞因子 肝脏和血清超氧化物歧化酶 （SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶 （GSH-Px）、 过氧化氢酶（CAT）的活性、总抗氧化能力（T-AOC）以及丙二醛（MDA）含量、肝脏TG 和TC 含量、血清雌激素（E2）、促卵泡生成素（FSH）、促黄体生成素（LH）、三碘甲状腺原氨酸（T3）、甲状腺素（T4）、生长激素（GH）、胰岛素样生长因子-I（IGF-I）含量、血清白细胞介素4（IL-4）、白细胞介素6（IL-6）、转化生长因子-β（TGF-β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量， 采用江苏宝莱生物的试剂盒严格按照说明书进行检测。

1.5.4 血脂 采用全自动生化分析仪测定血清甘油三酯（TG）、血清总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、极低密度脂蛋白（VLDL）和高密度脂蛋白（HDL）含量。

1.5.5 蛋黄脂质

1.5.5.1 蛋黄总磷脂（PL）标准曲线的绘制 按要求配制P 标准溶液，在420 nm 波长下，用紫外分光光度计测不同浓度溶液的吸光度。 以磷含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，计算标准方程及线性相关系数。 样品液制备以及样品测定：每个重复随机挑选5 枚鸡蛋，用蛋黄分离器将蛋黄蛋清分离，将蛋黄放入洁净的烧杯中，准确称取2 g 蛋黄，釆用乙醚-乙醇混合溶液提取鲜蛋黄中磷脂，然后加酸将提取物中有机物破坏，使P游离出来，在酸性溶液中用钒钼酸铵显色，在分光光度计上于420 nm 处测定， 根据P 含量换算成磷脂含量，换算公式如下：

式中：Y 为蛋黄总磷脂含量，%；25 为磷-磷脂系数；X 为P 的含量；2 为样品重；50 为稀释倍数（Shi，2013）。

1.5.5.2 蛋黄卵磷脂（LEC）标准液的测定和标准曲线的绘制 按要求配制卵磷脂标准液，在292 nm处分别测定不同浓度溶液的吸光度。 以标准品溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，计算标准方程及线性相关系数。 样品液制备：从每个重复中随机选取5 枚鸡蛋， 用蛋黄分离器将蛋黄蛋清分离，将蛋黄放入洁净的烧杯中，准确称取5 g 蛋黄，加入15 mL 的丙酮，室温下在磁力揽拌器下搅拌20 min 后过滤出油脂层，丙酮润洗至无色，倾出丙酮。将盛有丙酮不溶物的烧瓶置于电热恒温箱中，60 ℃恒温30 min， 挥发掉残余丙酮。 然后向烧瓶中加入25 mL 无水乙醇，40 ℃下搅拌90 min，液体过滤，取出滤液。 搅拌结束后，将样品液转移到100 mL 容量瓶中， 用无水乙醇定容至刻度。然后将溶液3000 r/min 离心10 min，待用。 样品测定： 取各样品滤液1.00 mL 分别于25 mL 容量瓶中， 其他步骤同标准曲线测定方法，根据标准曲线可得对应卵磷脂的浓度值， 最后换算成样品中卵磷脂的百分含量（Ting，2011）。

1.6 数据统计分析 试验数据采用“平均值±标准误”表示，数据分析分别采用SPSS 19.0 统计软件单因素方差分析（one-way ANOVA）和邓肯氏多重比较（Duncan），P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 QG 对蛋鸡生产性能的影响

2.1.1 QG 对蛋鸡产蛋率的影响 由表2 可知，试验期1 ～4 周、1 ～10 周，槲皮万寿菊素对蛋鸡产蛋率和料蛋比有显著影响；其中，1 ～10 周蛋鸡产蛋率分别显著提高12.25%、8.48%、10.21%（P＜0.05）。槲皮万寿菊素对5 ～10 周产蛋率无显著影响（P＞0.05）。

表2 QG 对产蛋后期蛋鸡产蛋率的影响 %

2.1.2 QG 对蛋鸡料蛋比的影响 由表3 可知，与对照组相比，试验期1 ～4 周，三水平QG 组蛋鸡料蛋比均显著降低 （P＜0.05），1 ～10 周，0.32%和0.64%槲皮万寿菊素组料蛋比显著降低10.32%、9.96%（P＜0.05），但三水平QG 组之间料蛋比差异不显著（P＞0.05）；试验期5 ～10 周，三水平QG 对料蛋比没有显著影响（P＞0.05）。

表3 QG 对产蛋后期蛋鸡料蛋比的影响

2.1.3 QG 对蛋重和日采食量的影响 由表4、表5 可知，与对照组相比，所有试验期内，三水平QG对蛋鸡平均蛋重和平均日采食量均无显著影响（P＞0.05）。

表4 QG 对产蛋后期蛋鸡平均蛋重的影响g

表5 QG 对产蛋后期蛋鸡平均日采食量的影响g

2.2 QG 对蛋鸡蛋品质的影响 与对照组相比，饲喂4 周槲皮万寿菊素，0.32%槲皮万寿菊素组蛋白高度、 哈氏单位分别显著提高23.36%、14.23%（P＜0.05），蛋壳厚度显著降低6.11%（P＜0.05），三水平QG 对鸡蛋蛋黄颜色、蛋壳强度无显著影响（P＞0.05）（表6）。 饲喂10 周槲皮万寿菊素，0.48%、0.64%槲皮万寿菊素组鸡蛋蛋壳厚度显著降低7.24%、12.33%（P＜0.05）， 其他指标各组均无显著差异 （P＞0.05）（表7）。 从蛋白高度、哈氏单位、蛋黄指数来看，饲喂4 周QG 对蛋品质的改善效果比饲喂10 周好。

表6 QG 饲喂4 周对产蛋后期蛋鸡蛋品质的影响

表7 QG 饲喂10 周对产蛋后期蛋鸡蛋品质的影响

2.3 QG 对蛋鸡抗氧化指标的影响 与对照组相比，饲喂4 周槲皮万寿菊素，三水平槲皮万寿菊素组蛋鸡肝脏SOD 活性显著提高149.43%、138.20%、38.76%（P＜0.05），0.32%、0.48%QG 组血清SOD 活性显著提高70.22%、73.68%（P＜0.05）， 肝脏MDA 含量显著降低51.92%、41.05%（P＜0.05）， 0.48%、0.64%槲皮万寿菊素组肝脏T-AOC 显著增加77.74%、50.77%（P＜0.05）（表8）；饲喂10 周槲皮万寿菊素，三水平槲皮万寿菊素肝脏和血清SOD 活性显著提高131.60%、100.50%、45.62%和104.52%、87.46%、26.01%，肝脏T-AOC 显著提高21.73%、48.59%、56.05%（P＜0.05）， 血清和蛋黄MDA 含量显著降低40.02%、27.57%、15.85%和51.60%、35.46%、15.34%（P＜0.05）（表9）。 从肝脏和血清GSH-Px、SOD、CAT、MDA、T-AOC 和蛋黄MDA 来看，饲喂4 周QG 提高产蛋后期蛋鸡抗氧化性能较饲喂10 周更好。

表8 QG 饲喂4 周对产蛋后期蛋鸡抗氧化指标的影响

表9 QG 饲喂10 周对产蛋后期蛋鸡抗氧化指标的影响

2.4 QG 对蛋鸡血脂的影响 与对照组相比，饲喂4 周槲皮万寿菊素， 三水平槲皮万寿菊素组血清TG、HDL 含量显著降低45.32%、34.88%、12.06%和40.09%、33.85%、11.21%（P＜0.05）（表10）；饲喂10 周槲皮万寿菊素，三水平槲皮万寿菊素血清TG 含量显著降低37.18%、34.59%、10.93%， 血清HDL 含量显著提高116.08%、100.97%、32.82%（P＜0.05），0.32%、0.48%槲皮万寿菊素组血清TC、LDL、VLDL 含量显著降低 （表11）。 从血清TG 来看，饲喂4 周QG 对产蛋后期蛋鸡降血脂的效果较饲喂10 周更明显。

表10 QG 饲喂4 周对产蛋后期蛋鸡血脂的影响

表11 QG 饲喂10 周对产蛋后期蛋鸡血脂的影响

2.5 QG 对蛋鸡肝脏和蛋黄脂质含量的影响与对照组相比，饲喂4 周槲皮万寿菊素，三水平槲皮万寿菊素组蛋鸡肝脏TG、TC 含量显著降低，0.32%、0.48%槲皮万寿菊素组蛋黄TG、TC 含量显著降低39.03%、29.30%和34.75%、26.01%（P＜0.05）， 0.48%、0.64%槲皮万寿菊素组蛋黄LEC 含量显著提高43.97%、38.13%（P＜0.05）（表12）；饲喂10 周槲皮万寿菊素，三水平槲皮万寿菊素组肝脏TG 和TC、 蛋黄TG 和TC、 蛋黄PL 和LEC含量均显著降低（P＜0.05）（表13）。 从肝脏TC、蛋黄TG、TC、蛋黄PL、LEC 来看，饲喂10 周比饲喂4 周效果好。

表12 QG 饲喂4 周对产蛋后期蛋鸡肝脏和蛋黄脂质含量的影响

表13 QG 饲喂10 周对产蛋后期蛋鸡肝脏和蛋黄脂质含量的影响

2.6 QG 对蛋鸡血清激素含量的影响 与对照组相比，饲喂4 周槲皮万寿菊素，三水平槲皮万寿菊素组FSH、T3 含量分别显著提高46.25%、75.41%、61.02%和74.89%、43.38%、78.08%（P＜0.05），0.32%槲皮万寿菊素组E2、LH 和IGF-1含量分别显著降低38.13%、20.21%和51.30%（P＜0.05）（表14）；饲喂10 周槲皮万寿菊素，三水平槲皮万寿菊素组LH 含量显著提高81.10%、128.21%、51.03%，T3 含量显著降低49.37%、41.66%、13.23%（P＜0.05），0.32%槲皮万寿菊素组 T4、GH、IGF -1 分别显著降低 43.24% 、34.41%、43.62%，FSH 显著提高48.79%（P＜0.05）（表15）。 从血清FSH、T3、T4 来看， 饲喂QG 4 周比饲喂10 周更好。

表14 QG 饲喂4 周对产蛋后期蛋鸡血清激素含量的影响

表15 QG 饲喂10 周对产蛋后期蛋鸡血清激素含量的影响

2.7 QG 对蛋鸡血清细胞因子含量的影响 与对照组相比， 饲喂4 周槲皮万寿菊素，0.32%QG 和0.48%QG 组IL-6、TNF-α 含量分别显著降低38.85%、29.21%和48.47%、40.67%，IL-4 含量分别显著提高110.37%、85.74%， 三水平槲皮万寿菊素组TGF-β 含量较对照组均显著降低（P＜0.05）（表16）；饲喂10 周槲皮万寿菊素，三水平槲皮万寿菊素均可显著影响IL-4、TNF-α、TGF-β 水平，而0.32%QG 组效果更明显，0.32%QG 和0.48%QG 组IL-6 分别显著降低42.72%、27.73%（P＜0.05）（表17）。 从血清IL-4、IL-6、TNF-α 来看，饲喂4 周QG比饲喂10 周抗炎效果好。 从蛋黄TG 和TC、 蛋黄PL 和LEC 来看，饲喂10 周QG 比饲喂4 周好。

表16 QG 饲喂4 周对产蛋后期蛋鸡血清细胞因子含量的影响pg/mL

表17 QG 饲喂10 周对产蛋后期蛋鸡血清细胞因子含量的影响pg/mL

3 讨论

3.1 QG 对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响 通常用蛋鸡产蛋率、料蛋比、平均蛋重、平均日采食量反映蛋鸡的生产性能。 Liu 等（2014）试验证明，槲皮素能提高蛋鸡的产蛋率。 饲料添加适量大豆黄酮能显著提高蛋鸡产蛋率，降低料蛋比（Shi 等，2013）。本试验证明适量QG 能显著提高蛋鸡产蛋率，降低料蛋比，进而提高蛋鸡生产性能，与大多数黄酮类化合物对蛋鸡的作用效果一致。

蛋鸡生产性能受下丘脑-垂体-性腺轴的调控， E2、LH、FSH、GH、IGF-I、T3 和T4 等多种激素与其密切相关 （Hewitt 等，2010；Ciccone 等，2005；Cos 等，2003）。Liu 等（2014）试验结果表明，饲料添加0.4 g/kg 槲皮素能显著提高蛋鸡血清E2、FSH、LH 含量，进而提高蛋鸡的产蛋率。 周玉传等（2002）试验证明，饲料添加适量大豆黄酮能显著提高鸭产蛋率、血清GH、IGF-I 水平，进而提高鸭生产性能。朱新建等（2004）试验证明，饲料添加适量大豆黄酮能显著提高蛋鸡血清T3、T4 水平， 提示黄酮类化合物能通过提高蛋鸡血清T4水平， 进而提高蛋鸡的生产性能。 本试验结果显示， 饲喂QG 能显著提高蛋鸡血清E2、FSH、LH、GH、IGF-I、T3、T4 含量，进而提高蛋鸡生产性能，提示QG 与其他黄酮类化合物一样， 能通过调控血清激素水平进而提高蛋鸡的生产性能； 同时发现， 饲喂4 周QG 蛋鸡血清E2 含量高于饲喂10周， 可能是由于第10 周QG 蛋鸡血清E2 水平下降明显， 添加QG 的弱刺激素样作用不足以阻止E2 的下降，因而提高产蛋率的效果不如饲喂4 周QG。

3.2 QG 对产蛋后期蛋鸡蛋品质的影响 蛋白高度、蛋壳强度、蛋壳厚度、破软壳率、哈氏单位、蛋黄颜色、 蛋形指数是反映蛋鸡鸡蛋蛋品质的重要指标。 Liu 等（2013）试验证明，饲喂槲皮素能提高产蛋后期蛋鸡鸡蛋蛋壳厚度、 蛋壳强度和哈氏单位。本试验结果显示，饲喂QG 能显著提高蛋鸡鸡蛋蛋白高度、哈氏单位、蛋形指数，显著降低破软壳率，提示QG 与其他黄酮类化合物相同，可以改善蛋鸡蛋品质。

肝脏和血清SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA、CAT 可反映蛋鸡的抗氧化性能。 试验证明橙皮素和柚皮素可以提高蛋鸡血清SOD、CAT 活性（Ting等，2011；Lien 等，2008）。 Li 等（2022）试验证明，饲料添加柚皮苷可以提高血清GSH-Px、CAT、SOD 活性和T-AOC， 降低MDA 含量。 韩立明等（2010）试验证明，大豆异黄酮能显著提高肥育猪血浆SOD、CAT 和GSH-Px 活性和T-AOC，显著降低MDA 含量。 贾琦珍等（2014）试验证明，饲料添加适量的小花棘豆黄酮能显著提高血清和肌肉组织SOD、GSH-Px、CAT 和谷胱甘肽还原酶活性，显著降低血清MDA 含量。 本试验结果显示，饲喂QG 能显著提高蛋鸡血清和肝脏SOD 活性和T-AOC，显著降低蛋鸡肝脏和血清CAT、GSHPx 活性和MDA 含量， 这与其他黄酮类化合物研究结果不完全一致，可能与黄酮化合物的种类、结构、活性、剂量、动物品种有关。

细胞因子是评估机体免疫能力的一个重要指标，在免疫应答中起关键作用，常用血清TNF-α、IL-4、IL-6 和TGF-β 反映蛋鸡免疫力。 Han 等（2002）试验证明，大豆异黄酮能显著提高小鼠血清IL-4 含量和IL-4 基因表达水平。 Horng 等（2017）试验证明，桑叶多酚能降低炎症细胞因子的产生，抑制NF-κB 信号通路，从而调控炎症反应。 本试验结果显示，QG 能显著提高蛋鸡血清IL-4 含量， 显著降低血清IL-6、TNF-α 含量，低水平血清TNF-α 和高水平IL-4 能避免NF-κB活化，提示QG 可能具有抗炎症作用。

3.3 QG 对产蛋后期蛋鸡脂质的影响

3.3.1 QG 对产蛋后期蛋鸡血脂的影响 血清TG、TC、LDL、HDL、VLDL 含量反映了蛋鸡血脂水平。 刘红南等（2014）试验证明，0.04%槲皮素可显著降低蛋鸡血清TG、TC、LDL-C。赵凤歧等（2008）在饲料中添加适量大豆黄酮能显著降低蛋鸡血脂。Feng（2017）等试验证明，饲料中添加适量白藜芦醇可显著降低蛋鸡血脂。 Lien 等（2008）和Ting等（2011）试验证明，饲料添加槲皮素能降低蛋鸡血脂，可能是由于槲皮素能抑制HMG-辅酶A 还原酶活性的作用。 Lien 等（2008）试验证明，饲料添加橙皮苷和槲皮素能降低血清胆固醇。 本试验结果进一步证实了QG 与其他黄酮类化合物同样具有降低蛋鸡血脂的作用。

3.3.2 QG 对产蛋后期蛋鸡肝脏和蛋黄脂质含量的影响 肝脏和蛋黄TG、TC， 蛋黄PL、LEC 均可反映蛋鸡脂质代谢状态。徐国银（2007）证明，大豆黄酮能降低蛋黄胆固醇含量。 呼林林等（2013）证明，0.02%、0.04%槲皮素可极显著降低蛋黄TC 含量。尹靖东等（2004）证明，大豆黄酮能显著降低蛋黄TC，对肝脏TC 有降低趋势。Iskender 等（2017）证明， 饲料添加橙皮苷和槲皮素均能降低蛋黄胆固醇。本试验结果显示，饲喂QG 显著降低肝脏和蛋黄TG、TC 含量， 提示QG 可能通过提高血清E2 含量，影响雌激素与下丘脑和垂体雌二醇受体的结合，调节雌激素活性，影响神经内分泌系统生长轴，从而影响蛋鸡的胆固醇代谢。 Hu（2013）发现，适量的槲皮素可显著提高蛋黄PL 含量。 本试验结果显示， 饲喂QG 可显著降低蛋鸡蛋黄LEC和蛋黄PL 含量， 与其他黄酮类化合物研究结果不一致，其原因有待于进一步研究。

4 结论

本试验结果表明，短期饲喂适量的QG 提高生产性能、改善蛋品质、降低脂质沉积的效果比长期饲喂明显， 本试验条件下，QG 的最适添加量为0.32%。