周沫希，吕祥敏，敬婧，易虹宇，张玲玲，唐游*

重庆中烟工业有限责任公司（重庆 400060）

烟草作为一种重要的经济作物，是生产香烟的主要原料。从烟草农作物到成品香烟需要经过育种、栽培、制丝、卷接和包装等工序，而指纹图谱技术作为一种现代化的鉴定分析手段，其应用贯穿香烟生产的全部过程。如在烟草作物种质资源鉴定领域应用广泛的DNA指纹图谱[1-2]，以及在烟草制品成分分析和质量控制等领域广泛应用色谱指纹图谱[3]或光谱指纹图谱[4]等。

指纹图谱主要是指某些具有复杂成分的物质、有机体的核酸或蛋白质等经过特殊处理之后，采用一定的分析手段，获得能够表征其化学特征的图谱[5]；又因特定物质所含成分往往固定，获得图谱通常具有独特性，与指纹具有唯一性的特征类似，固称之为指纹图谱。指纹图谱主要被应用于中药领域，作为中药质量评价和控制的重要手段[6-7]，其应用范围也扩展到烟草生产领域，且逐渐成为烟草行业的主流分析技术之一[8]。对指纹图谱在烟草生产过程中的应用进行介绍，以期该技术能为烟草的现代化生产提供参考。

1 在烟草育种领域的应用

烟草作物的品种直接影响其产品的质量，因此，鉴定并培育优良的烟草品种能直接改善产品的质量。传统的植物品种鉴定主要是通过观察其形态，但该方法准确性较差。已发展多种分子生物学检测手段如核酸测序[9]、DNA指纹图谱等，其鉴定结果高度的准确性使这些技术逐渐成为主流的鉴定方法。其中，又以DNA指纹图谱操作简单、准确率高而应用广泛[10]。

DNA指纹图谱是指利用DNA探针杂交技术，或者以待鉴定物种基因组为模板进行特定的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），通过电泳或者测序，获得不同长度DNA产物组成的条带图谱或者序列信息图谱，这种图谱极少会有2个个体完全相同，因此被称为“DNA指纹”。该技术的个体特异性使其被广泛应用于法医学[11]。亲子鉴定[12]及家谱和医学研究近些年也被应用于动物学、植物学和农业领域的动物和植物种群研究[13-14]。根据检测方式和引物设计的差异，主要分为片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）[15-16]、随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）[17]、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）[18-19]、序列相关扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）[20]、重复序列区间扩增（simple sequence repeats，SSR）[21]、简单序列间重复（inter-simple sequence repeats，ISSR）[22-23]，以及基于测序技术的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）指纹图谱[24-25]等。DNA指纹图谱的一般检测流程如图1（A）所示。Lin等[26]以皱叶烟草和长花烟草的杂交二代为研究对象，检测到69个RFLP位点和102个RAPD位点，由此构建2种烟草的遗传连锁图，揭示2种烟草在进化过程种发生基因重组且该过程伴随着特定类别的DNA序列的获得或丢失。Ren等[27]通过AFLP的方法对46个栽培烟草品系和7个野生烟草物种进行遗传变异程度的分析，结果发现栽培烟草品系之间存在的遗传多态性有限，而野生烟草物种之间的遗传多态性比栽培品系之间的更丰富。对野生和栽培烟草的AFLP图谱进行配对比较表明，栽培烟草中存在的多态性条带至少可以在3个野生祖先物种中的一个中找到，这些结果加强对烟草起源的了解。胡重怡等[28]利用ISSR标记的方法，对贵州的12个地方品种（系）及5个主要种植品种进行区分，筛选出9条引物能扩增获得显著的多肽性，可将17个品种（系）区分开，显示该方法在烟草品系鉴定上很强的实用性。He等[1]利用270对SSR候选引物对烤烟标准品种进行PCR扩增，其中91对出现清晰的扩增条带，并从中筛选出48对SSR引物构建33个烤烟标准品种的遗传指纹图谱，建立基于SSR指纹图谱的烤烟新品种鉴定技术。采用RAPD指纹图谱对孟加拉邦的11份烟草种质的亲缘关系进行评价[29]，利用该方法可将亲缘关系较近的烟草种质进行有效区分。王琰琰等[30]利用SNP核心标记对我国现有的220份雪茄烟资源进行指纹图谱绘制，为雪茄烟的育种提供宝贵的借鉴资源。

图1 指纹图谱检测的一般流程

此外，DNA指纹图谱在烟草病虫害防治领域也有一定应用。郭生云等[31]利用RAPD指纹图谱分析筛选出2种分别与烟草赤星病和烟草黑胫病抗性基因连锁的标记；刘国祥等[32]利用SSR指纹图谱技术对30份野生烟种质进行抗病性基因鉴定，结果发现不同种质在抗黑胫病、青枯病、烟草花叶病、黄瓜花叶病和马铃薯Y病等常见病害的优异基因。这些研究为烟草质量性状选择提供有效借鉴。

2 在烟草产品质量评价的应用

烟草中所含化合物成分复杂，从烟叶中鉴定出的化学成分已超出6 000种，烟叶中化学成分的组成与含量决定其卷烟制品的品质。此外，由烟草燃烧产生的烟气除了含有烟草的某些化学组分，燃烧所发生化学反应赋予烟气更复杂的成分组成，直接决定香烟的香味与口感。针对烟叶与烟气的分析，通常仅针对少部分主要的成分，以此进行烟草质量控制与品质评价，主要成分能基本评判烟草的品质，但对于同种烟草的不同批次区分，该方式往往力有未逮。因此，针对烟草成分特征进行精细刻画表征的技术亟待进步，而以指纹图谱为代表的精确表征方法在烟草分析领域正快速发展。

在成分分析检测领域的指纹图谱主要是指光谱或者色谱指纹图谱，其中光谱指纹图谱又根据光源区分为紫外光谱、红外光谱、荧光光谱、核磁共振光谱以及拉曼光谱等。色谱指纹图谱根据色谱类型又分为薄层色谱、液相色谱和气象色谱等。其中，薄层色谱具有重现性好、操作简单快速等特点，但由于其精度较差，需要结合其他仪器对薄层板上的斑点进行再次检测，因此在烟草行业应用不多。光谱和色谱指纹图谱的一般检测流程如图1（B）所示。

紫外光谱是指分子外层价电子吸收紫外光后发生跃迁所产生，主要是由化合物中共轭结构决定的。利用紫外光谱可对物质成分和含量进行检测，其可操作性强，成本低，在化学分析领域广泛使用，其缺点是无法有效区分吸光度相近的物质，因此会结合其他检测技术进行联用，如紫外-可见光谱技术[33]。关丽芬[34]利用多种溶剂对烟叶样品进行萃取，获得烟叶醇化前后的紫外光谱组指纹图谱，以此判断烟叶的醇化度。该方法有效避免单一紫外光谱需要进行繁琐的溶剂选择，同时更全面描绘样品特征，也可应用于原料或产品仓储质量评价领域。红外光谱主要用于研究化合物中特定的官能团结构[35]，其检测过程快速，且重复性好，但无法进行精确定量，多用于鉴别物质的化学成分，如在食品或者中药领域区分材料的真假[5]，在烟草领域也有所应用。谢有超等[36]利用近红外光谱绘制贵州中烟生产的10种卷烟烟丝的指纹图谱，结合机器深度学习技术，构建卷烟品牌的识别模型，该研究也可应用于卷烟的真伪辨别。

液相色谱具有分离性能良好、重现性好、灵敏度高等特点在指纹图谱绘制方面应用颇多[37-38]。张双双[39]利用高效液相色谱对15批不同产地的烤烟样品进行指纹图谱绘制，结果发现15批样品在主要化学成分类型上基本一致，但在含量上表现较大差异，可能是烟草生长环境的差异造成的。唐徐红等[40]利用高效液相色谱分析技术对云南典型烤烟进行研究，建立基于液相色谱的指纹图谱技术规程及指纹图谱分时数据库，实现在任意时段根据需求提取烤烟指纹图谱的特征峰，并建立烟碱、总糖及糖碱比等烟草品质指标与指纹图谱的回归模型。气相色谱在挥发性物质鉴定方面独具优势[41]，这也使该技术在烟草分析领域占据主导地位，该技术是烟草领域构建指纹图谱的主要方法之一[42]。余苓等[43]开发利用硅烷化气相色谱对卷烟烟丝样品进行检测，并对获得的指纹图谱进行降维处理分析，利用该方法可有效判断不同生产工艺对卷烟制品质量的影响，并能区分产品中的异常品。廖堃等[44]运用固相微萃取及气相色谱质谱联用的技术建立卷烟制品中挥发性与半挥发性成分的指纹图谱，并通过正品与假冒香烟之间图谱的对比，揭示两者之间的成分差异，利用该技术能有效辨别香烟样品的真伪。

3 在香精香料评价中的应用

卷烟的配料配方是烟草企业的核心，而香精香料作为卷烟生产的重要配料之一，其添加修饰卷烟的口味，决定卷烟的风格特点。烟用香精香料来源于天然产物或者化学合成，经过组合调配制成，因此烟用香精香料组成成分复杂。对其进行有效的质量控制也是该领域的重点与难点，对其质量评价主要依赖于评香师的人工品析，该方法往往存在较强的主观性；或采用常规的理化指标进行简单检测分析，无法实现精确控制。基于色谱的指纹图谱作为一种能反映烟用香精香料组分含量整体分布特征的技术，在香精香料化学分析领域逐渐占据主导地位。

王钧等[45]就色谱指纹图谱的概念做了详细阐述，认为色谱指纹图谱反映的是香精香料的整体质量信息，体现样品的整体性和数学模糊性，说明色谱指纹图谱进行香精香料质量控制的一般步骤及该方法的有效性。杨蕊等[46]利用气相色谱与质谱联用的技术对调配后的香精进行成分剖析，通过该方法可以准确判断候选香原料是否在该香精中添加，实现在混合物中对混合物进行定量分析，利用该技术可以辅助调香师进行香精调配与仿香。王平等[47]采取同时蒸馏萃取和气相色谱法技术对12个来自于不同生产批次的香精香料进行分析并绘制指纹图谱，通过对指纹图谱的相似性分析可以明显区分香精香料与烟叶提取物的差异。除了利用色谱指纹图谱进行香精香料的评价，Xu等[48]以金纳米薄膜为基材，利用表面增强拉曼光谱指纹图谱对卷烟的香精质量进行评价，利用该方法结合主成分分析可以轻松区分卷烟调味中所使用的香精类型。

4 指纹图谱的常用分析方法

在获得多个样品的指纹图谱后，需要对样品间的共性与差异进行分析，通常采用的方法有化学模式识别及相似度评价等方法。这类分析方法多用于中药材及食品领域的指纹图谱分析，用于解析样品中的化学成分。仅就常用于与烟草分析领域的相关的几种方法做简要介绍，如主成分分析法、偏最小二乘法、聚类分析法及相似度评价等。

通常主成分分析法作为一种无监督的化学模式识别方法，不需要预先了解样本的先验信息，通常用于样本的区分，这种指纹图谱分析方法在烟草分析领域使用广泛。其原理是利用正交变化将多个变量简化为少数综合性变量，并利用综合性变量代表样本的突出信息。该方法在面对处理多个变量时可从众多指标中合理地选出保留样本绝大部分信息的几个指标，减少指标选择的工作量。王平等[47]对获得的烟草香精色谱指纹图谱进行主成分分析，结果发现前3项主成分能解释矩阵方差的93%。王佳俊等[49]对分批收集的3种烟用香精进行红外指纹图谱绘制，并对获得的指纹图谱进行主成分分析及马氏距离法分类建模，利用该模型可以实现香精配制过程种质量的多元统计过程控制，实现对香精的整体监控。偏最小二乘法是一种监督模式的化学识别方法，该方法需要一些已知类型的样本作为训练集来构建鉴别模型，并利用该模型推测检测样本的归属性。Hou等[50]利用顶空固相微萃取及质谱联用的技术构建香精的质谱指纹图谱，并利用偏最小二乘法分析构建能预测样品属性的离子标记物模型，通过这一方法可以识别并监控香精的质量。

聚类分析法可将样品分为几组，组内的样品表现出较高的一致性，而组间的样品差异性较大。汤晓东等[51]结合气相色谱对烟丝裂解产物进行分析，并利用聚类分析与主成分分析建立卷烟评价模型，通过聚类分组可以准确识别区分4个不同品牌的香烟。相似度分析多用于评价个体间的差异大小，常用方法有夹角余弦法、欧式距离法和相关系数法等。夹角余弦法是将指纹图谱看成多维空间内的向量，通过比较样品指纹图谱特征向量与共有标准向量之间的夹角余弦值，以判别样品的相似度。欧氏距离则是对图谱中的每个特征向量与该向量的共有均值模式向量差值的平方进行求和，求平方根得到的一个值，该值可以反映样品间的相似程度。相关系数法也是将样品的特征向量与共有模式均值向量进行统计学的相关系数计算来比较样本与样本之间的相似程度。王小龙等[52]对红塔山品牌不同生产点卷烟烟丝样品的挥发性与半挥发性成分进行测定，并获得其化学指纹图谱，通过欧氏距离分析，结果发现4个生产点的样品间存在明显差异，利用该分析方法能有效区分样品的生产批次。李希强等[53]通过夹角余弦与欧氏距离2种方法评价不同批次烟用香精的HPLC指纹图谱，结果发现欧氏距离相较于夹角余弦能更有效反映样本中成分的含量变化，而2种方法结合使用可以更加快速便捷地判别香精的质量稳定性；对3种方法对烟用香精UPLC指纹图谱的判别进行评价[54]，结果发现三者都能一定程度反映香精的质量改变，夹角余弦和相关系数在表征上比较相似，但在浓度变化比较小时表现不够明显，而欧氏距离能更灵敏地反映香精种类和浓度的变化。

5 展望

指纹图谱作为一种能反映样本整体特征的表征手段，其所含信息的丰富性更加适应现代化生产对产品质量精确把控这一特点。指纹图谱贯穿烟草生产的各个环节，就指纹图谱在烟草领域中的应用进行综述，对烟草生产的标准化制订及质量控制提供一定参考。关于指纹图谱在烟草领域的进一步发展应用可从几个方面进行深入探索。

一是针对样品获取指纹图谱所采用前处理方式大相径庭，因此不同的研究获得的图谱数据往往无法进行共享或互相比较，缺乏有效的标准进行统一规范，这无疑会导致无意义的重复以及资源的浪费，因此可以尝试建立标准化的规程，规范数据获取过程，从而使烟草生产体系更加健全完善。

二是现阶段指纹图谱数据的获取往往会结合测序、色谱、质谱或其他光谱仪，大多需要对样品进行繁琐的前处理过程，这使图谱数据获得的成本增加，因此简化样品前处理过程也非常有必要。

三是现代化的烟草生产过程往往规模庞大，而对单个样品或少数样品进行指纹图谱数据获取显然无法满足生产需求，因此高通量的指纹图谱获取技术也亟待发展。

6 结语

近些年，指纹图谱技术在烟草领域的应用取得了良好的效果，包括DNA指纹图谱、紫外光谱、红外光谱、荧光光谱等，在种质鉴定、质量控制、产品评价等方面发挥了重要作用。但这些方法在具体应用过程中也存在一定局限性，因此，应结合具体情况，因情制宜地选择合适的指纹图谱技术，以获得更可靠的分析结果。同时，其他领域的新兴技术近些年也取得了巨大发展，紧跟这些技术并将其应用于烟草领域对烟草行业的可持续发展具有重要意义，需要我们时刻关注。