郭正畅，刘智禹，方旭波,3，陈小娥,*，周小敏，李 真，马宇乔，陈 贝，高潇楠，杨会成

（1.浙江海洋大学食品与药学学院，浙江 舟山 316022；2.福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013；3.浙江国际海运职业技术学院，浙江 舟山 316021；4.浙江兴业集团有限公司，浙江 舟山 316000，5.浙江省海洋开发研究院，浙江 舟山 316021）

鲐鱼（Pneumatophorus japonicus）又名青占鱼、鲭鱼，具有分布广、产量高等特点[1]，为我国近海主要捕捞的中上层鱼类[2]。目前鲐鱼主要以鲜食为主，除了少部分用于低值鱼粉加工外，精深加工程度严重不足，其销售价格低廉，对经济效益产生了负面影响[3]。对鲐鱼进行深加工、提高其产品附加值是目前亟需解决的一个问题。研究表明，鲐鱼的蛋白质含量很高，富含钙、磷、铁等微量元素，是优质的水产蛋白来源，而酶水解法是促进鱼类蛋白高值化利用的有效途径[4]，但鱼类酶解液存在腥味重、气味不协调等缺点[5]，限制了其在食品工业中的应用。

产香菌可以产生多种芳香化合物及特别的风味物质，有助于改善发酵产品的总体风味[6]。利用产香菌改善鱼蛋白酶解液风味品质，制备新型海鲜调味基料，提高水产品附加值已成为近年来的研究热点。汤玉洁等[7]在金枪鱼碎肉酶解液中加入植物乳杆菌进行发酵后，乙醛等腥味化合物含量降低，风味得到改善。本课题组前期利用长孢洛德酵母对远东拟沙丁鱼酶解液进行增香发酵处理，结果表明，发酵后酶解液腥味降低，鲜味氨基酸和挥发性风味物质等含量明显增加[8]。

另一方面，低频超声技术（16～100 kHz）在发酵食品中的应用近来也逐渐受到关注，相关研究工作主要集中在酒、醋、酱油和果蔬汁等产品上，研究表明，低频超声产生稳定的、温和的空化效应[9]，可以促进发酵液中的微生物代谢、缩短发酵时间、改善发酵食品的风味品质[10]。舒杰等[11]发现超声处理可以对黄酒产生催陈效果。张媛渊等[12]发现，与未处理的食醋相比较，经超声波催陈后的新醋色泽棕红、口感良好、醋香较温和、酯香味更加浓郁。Gao Xianli等[13]同样发现，经超声处理后大豆酱油的风味物质含量明显提高，口感更加和谐。鉴于此，将超声波技术与酵母菌产香发酵技术相结合并应用于鱼蛋白酶解液的增香发酵中，推测不仅可以使鱼蛋白酶解液的发酵时间缩短，还可以改善产物的风味品质。然而，国内外关于这方面的应用研究鲜有报道，故值得深入研究。

本研究以鲐鱼蛋白酶解液为基质，利用超声波辅助长孢洛德酵母菌发酵增香，研究超声波技术对鲐鱼酶解液发酵过程中菌落数、氨基酸态氮含量、感官评分的影响，并通过主成分分析（principal component analysis，PCA）判别发酵过程中超声与未超声条件下产物风味的差异，旨在探明在不同发酵阶段发酵鲐鱼酶解液经超声处理后风味品质的变化情况。同时，本研究还对发酵产物进行游离氨基酸组成分析和必需氨基酸营养评价，并采用气相色谱-离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）技术分析发酵产物中香气物质差异，以期为超声波技术在新型海鲜调味料的应用研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲐鱼购自舟山市海利远洋渔业有限公司，平均体长15～25 cm，-20 ℃冰箱冷冻保存。

长孢洛德酵母由浙江海洋大学水产食品化学实验室保存。

动物蛋白水解酶（1×105U/g）南宁庞博生物工程有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SPX-250 B-Z型生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；PEN 3电子鼻便携式系统德国Airsense公司；全自动氨基酸分析仪 美国Pickering公司；FlavourSpec®风味分析仪 德国GAS公司；超声处理仪上海科导超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

取斜面培养基上保存的长孢洛德酵母接种于YPD液体培养基中，于28 ℃的条件下培养72 h，作为活化的种子液备用[14]。

1.3.2 鲐鱼蛋白酶解液的制备

将流水解冻后的鲐鱼搅碎[15]，鲐鱼蛋白酶解液的制备参照刘温等[16]的方法并作修改，按照料液比1∶2加入蒸馏水，体系中动物蛋白水解酶添加量为4 000 U/g，加酶后的样品置于55 ℃酶解罐中酶解6.5 h，反应结束后灭酶（90 ℃水浴20 min）20 min，冷却至室温进行离心（5 000 r/min、10 min），取上清液，置于4 ℃冰箱冷藏备用。

1.3.3 发酵体系的建立

根据前期的预实验结果，鲐鱼蛋白酶解液灭菌后进行发酵培养，酶解液接种体积分数1%的种子液，35 ℃的条件下进行静态发酵[17]，在接种发酵后的0、3、6、9、12、15 d对发酵液进行超声辅助处理（40 ℃、120 W、10 min），并在超声处理后取样，取样后样品继续发酵。同时以相同条件下发酵且未作超声处理的发酵液作为对照组，测定相关指标。超声过程中控制超声机内槽液面始终高于鲐鱼蛋白酶解液液面。

1.3.4 菌落数测定

采用平板菌落计数法测定发酵液中的长孢洛德酵母菌数量，结果以lg（CFU/mL）表示。

1.3.5 氨基酸态氮含量测定

参照陈启航等[18]的报道采用甲醛滴定法测定氨基酸态氮含量。

1.3.6 电子鼻分析

参考邝格灵等[19]的方法，在烧杯中加入1/3体积的发酵液，用保鲜膜封口，静置15 min后进行检测。测定时间98 s，载气流速和进样流速均设置为200 mL/min。通过PEN 3电子鼻的WinMuster软件对采集到的样品气味信息进行PCA。

1.3.7 感官评价

感官评价根据陈启航等[20]的方法并进行修改，由10 名经过专业培训的感官评定人员组成品评小组，进行感官评价。每组发酵液分别量取50 mL并随机编号，每组做3 个平行，采用先闻后尝的方式，按照表1所示评分标准[21]进行打分并记录结果。

表1 鲐鱼发酵液感官质量评定标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented mackerel enzymatic hydrolysate

1.3.8 游离氨基酸含量的测定及营养评价

取发酵12 d超声处理组样品，以未超声处理组样品为对照，参照卫阳飞等[22]的方法并稍作修改测定游离氨基酸含量，取1 mL样品置于50 mL离心管中，加入三氯乙酸（终质量分数5%）进行离心（4 ℃、15 000 r/min、30 min），用滤膜（0.22 μm）过滤离心后的上清液，放入氨基酸自动分析仪样品盒中上机测定。参照杨超等[23]的方法，对发酵产物的氨基酸评分（amino acids score，AAS）、化学评分（chemical score，CS）及必需氨基酸指数（essential amino acids index，EAAI）计算。

1.3.9 GC-IMS分析风味变化

取发酵12 d的超声处理组样品，以未超声处理组样品为对照，使用FlavourSpec®风味分析仪检测和分析挥发性风味物质，每个实验重复3 次。参照赵玲等[24]的方法并略作修改，分别量取1 mL发酵液于20 mL的顶空瓶中，密封，然后将样品在40 ℃下孵育20 min，孵育转速500 r/min。采用顶空自动进样的方式将500 μL的样品注入进样器中，进行检测。

检测条件：色谱柱为FS-SE-54-CB-1 型（15 m×0.53 mm）；载气：高纯N2（纯度≥99.999%）；柱温：60 ℃；分析时间：30 min；初始流速为2 mL/min，保持2 min，在2～10 min内线性上升至10 mL/min，10～20 min内线性上升至100 mL/min，20～30 min内线性上升至150 mL/min，电离源为β射线（氚3H），漂移气为高纯N2（纯度≥99.999%），温度45 ℃，流速150 mL/min，正离子模式。

1.4 数据处理与分析

应用Origin 2021软件绘图，使用SPSS 18.0软件对实验数据进行显著性分析，以P＜0.05表示差异显著；电子鼻数据采用自带软件分析；GC-IMS测定结果通过比对NIST、IMS数据库进行定性分析，然后采用GalleryPlot功能绘制样品的挥发性成分谱图。

2 结果与分析

2.1 超声辅助处理对鲐鱼蛋白酶解液发酵过程中菌落数的影响

由图1可知，随着发酵的进行，发酵液的菌落数呈上升趋势，发酵到第12天时进入稳定期。此时，超声处理组菌落数为8.90（lg（CFU/mL）），显著高于对照组（8.50（lg（CFU/mL）））（P＜0.05）。从趋势上看，在整个发酵过程中，超声处理组菌落数均高于未超声处理组，这与Huang Guoping等[25]的研究结果相似，表明在适当的超声强度下，长孢洛德酵母的生长速率得到提高。这一现象可能是因为超声波产生的空化效应提高了长孢洛德酵母细胞膜的通透性，加快了其新陈代谢的速率，从而促进其生长繁殖[9]。

图1 超声处理对鲐鱼酶解液发酵过程中菌落数的影响Fig.1 Effect of ultrasound on total bacterial count during the fermentation of mackerel enzymatic hydrolysate

2.2 超声辅助处理对鲐鱼蛋白酶解液发酵过程中风味品质的影响

2.2.1 超声辅助处理对鲐鱼蛋白酶解液氨基酸态氮含量的影响

氨基酸态氮含量是考察发酵液营养价值的一项重要指标[26]，由图2可知，发酵过程中，各组氨基酸态氮含量均有所提高；直至发酵第12天，超声处理组氨基酸态氮含量升至0.78 g/100 g，此后增势趋于平缓，与第15天相比无显著差异（P＞0.05）。整个发酵过程中，超声处理组样品的氨基酸态氮含量均大于未超声组，原因可能是超声处理促进了长孢洛德酵母的生长繁殖，使其在释放香气物质的同时产生了少量的氨肽酶，促进了酶解液蛋白的水解，有利于更好地利用鲐鱼原料蛋白。

图2 超声处理对鲐鱼酶解液发酵过程中氨基酸态氮含量的影响Fig.2 Effect of ultrasound on the content of amino acid nitrogen during the fermentation of mackerel enzymatic hydrolysate

2.2.2 超声辅助处理对鲐鱼蛋白酶解液感官品质的影响

为确保产品被消费者接受，通常采用感官分析来评价食物的特性（质地、味道、外观以及气味等）[27]。由图3可知，随着发酵的进行，发酵液的感官评分不断升高，12 d时达到最大值，之后略有下降。与未超声处理组样品相比，超声处理组样品鲜香味更加浓郁，伴有果香味，而腥臭味几乎察觉不到，其感官评分在发酵期间均显著高于未超声处理组（P＜0.05），风味更容易被人们接受，这与刘二蒙[28]的研究结果一致。

图3 超声处理对鲐鱼酶解液发酵过程中感官评分的影响Fig.3 Effect of ultrasonic on sensory evaluation score during the fermentation of mackerel enzymatic hydrolysate

2.2.3 电子鼻分析

由图4可知，主成分（principal component，PC）1和PC2的贡献率分别为97.69%和1.64%，总贡献率为99.33%，说明电子鼻PCA可以达到较好的区分效果，这与刘丽丽等[29]的研究结果相似。除发酵0 d外，超声处理组和未超声处理组随发酵时间的延长均得到了较好的分离，且发酵12 d 的超声处理组样品在PC1方向上与发酵0 d的超声处理组样品差距达到最大。在相同发酵时间下，超声处理组样品在PC1方向上与0 d样品的差距均大于未超声组。

图4 发酵过程中不同处理方式下发酵产物的PCA图Fig.4 PCA plot of fermented products with different treatments during fermentation

综合图2和图3可知，长孢洛德酵母辅助鲐鱼酶解液发酵的最适时间为12 d，且超声辅助处理对发酵液的风味品质有重要影响。

2.3 发酵产物中游离氨基酸组成分析及相关营养评价

发酵12 d后，超声处理组与未超声处理组中游离氨基酸酸含量如表2所示，两组样品中均检出17 种游离氨基酸，且组成成分相同，但含量存在显著差异。未超声处理组中游离氨基酸总量为4.984 g/100 g，而超声处理组中游离氨基酸总量则达到6.373 g/100 g，增加了27.87%。其中，鲜味氨基酸Ala、Glu与His、Tyr、Cys-s等具有抗氧化能力的氨基酸含量明显增加，这几种氨基酸有可能是超声辅助处理改善发酵液风味品质的重要因子。

表2 发酵产物中游离氨基酸组成分析及相关营养评价Table 2 Analysis of free amino acid composition in fermented products

AAS和CS是两项评价食品营养价值的指标。由表3可知，当以AAS为评分标准时，超声处理组的鲐鱼发酵液中苯丙氨酸＋酪氨酸评分最高，苏氨酸评分最低。以CS为评分标准时，超声处理组的鲐鱼发酵液中评分最高和最低的分别是苯丙氨酸＋酪氨酸和蛋氨酸。EAAI常用来评价蛋白质的营养价值[30]，鲐鱼发酵液的EAAI为82.90，表明其营养价值较高，可以作为理想的海鲜调味基料。

表3 发酵产物中必需氨基酸营养评价Table 3 Nutritional evaluation of essential amino acids in fermented products

2.4 超声对发酵过程中挥发性香味物质动态变化分析

发酵12 d后，超声处理组和未超声处理组样品中挥发性化合物的GC-IMS图谱如图5所示，横坐标1.0处红色竖线为经归一化处理后的反应离子峰（reactive ion peak，RIP），RIP两侧的每一个点代表一种挥发性有机物。根据色点的有无或者颜色深浅可以直观地看出物质浓度的高低，白色表示浓度较低，红色表示浓度较高，颜色越深浓度越高[31]。从图5中可以看出，不同样本中的特征挥发性组分可以通过GC-IMS技术得到很好的分离，超声处理组与未超声处理组具有不同GC-IMS的特征谱信息，超声处理组中红点数量多于未超声处理组，如图中圆圈标注的位置，两者之间存在着明显的差异。

图5 超声处理组（A）与未超声处理组（B）中挥发性化合物的GC-IMS图谱Fig.5 GC-IMS spectra of volatile compounds in ultrasonic (A) and control (B) treatment groups

将两组挥发性化合物的保留时间和迁移时间与GC-IMS自带软件Library Search中现有的NIST 2014气相色谱保留指数数据库和G.A.S.的IMS迁移时间数据库进行比对，最终分析出48 种挥发性化合物，主要包括醛类12 种、醇类9 种、酮类13 种、杂环类8 种、芳香类及其他化合物6 种（表4）。

表4 酶解液GC-IMS测定结果Table 4 GC-IMS results of enzyme digests

为进一步研究超声对发酵液挥发性化合物的影响，通过LAV软件对经超声处理和未经超声处理的发酵液（发酵12 d）挥发性化合物进行三维对比，每个实验重复3 次，形成样品指纹图谱，如图6所示。图6中每一行代表一个样品中选取的全部信号峰，每一列代表同一挥发性有机物在不同样品中的信号峰，从图中可以直观地比较出每种样品之间挥发性有机物的差异，亮点的深浅表示化合物含量的高低。A、B区的物质是未超声处理组样品中的特征风味物质，包括2,5-二甲基吡嗪、甲二磺醛、3-甲基-2-丁烯醛、2-丁醇、二甲基二硫醚、噻吩等；C区代表超声处理组样品中的特征风味物质，包括1-丙醇、1-丁醇、1-辛醇、2-庚基呋喃、2-丁基呋喃、异戊酸乙酯等。与对照组相比，超声处理组中酯类、酮类、醇类物质含量有所增加，醇类通常具有植物香、芳香气味，适量的酮类贡献甜的花香和果香味。以上结果表明，超声辅助处理可以促进鲐鱼酶解液的发酵进程，加速其香味物质的形成，提高香气质量。

图6 超声与未超声处理组GC-IMS指纹图谱Fig.6 GC-IMS fingerprints of ultrasonic and non-ultrasonic treatment groups

3 讨论

研究发现，微生物发酵法可以作为一种绿色的发酵技术，能够有效改善水产品风味[32]。现阶段采用的发酵菌种主要为酵母菌，它们中大部分为能够产生芳香类化合物的风味菌，有利于促进发酵食品风味的形成，提高其风味品质[33]。朱文慧等[34]将耐盐酵母接种于鳕鱼骨酶解液中，结果显示，发酵后的鱼骨酶解液香气活性化合物含量明显增加。李学伟等[35]发现在酱油发酵生产过程中添加耐盐酵母后，其产物酱酯香和醇香更加浓郁，风味改善明显。本研究将超声波技术与酵母菌产香发酵技术相结合，利用超声波技术对鲐鱼酶解液促进发酵增香，改善了发酵液的风味品质。

另有研究发现超声辅助处理能够加快发酵食品的成熟，促进微生物增长繁殖、提高其代谢性能，使发酵产物的风味品质得到进一步的提高，如Yu Zhou等[36]研究发现超声处理对食品的发酵和熟化有促进作用，超声处理后的发酵食品质地、颜色、风味和口感等感官属性均得到改善。孟祥勇等[37]同样发现，经超声处理的黄酒醪液，发酵时间缩短，其风味物质含量明显提高，口感更加和谐。本研究利用超声技术辅助鲐鱼酶解液发酵增香。结果表明，在同一发酵时间下，超声处理组中的菌落数、氨基酸态氮含量和感官评分均大于未超声处理组。这可能是由于低频超声波能产生稳定且较温和的空化效应对菌体细胞造成可修复的损伤，增加了细胞膜的通透性，加速细胞内外物质的传输，提高了新陈代谢速率。此外，超声波还可以将微生物在培养过程中形成的细胞束松散开来，提高菌体对营养物质的利用率，促进了菌体的生长繁殖和代谢，提高了微生物的生物量，从而改善了发酵液的风味品质。这与汪雨晨等[38]的研究结果相似。

GC-IMS是食品中挥发性化合物分离和定量的常用方法，因具有强分离能力、高灵敏度、快速响应、二维分离和痕量分析等特点[39]而备受关注。江津津等[40]采用GC-IMS技术对不同产地的海虾酱进行风味分析，发现不同虾酱的挥发性成分种类和含量差异显著，2-乙基己醇、3-乙基-2,5-甲基吡嗪、二甲胺、二甲基三硫和3-甲硫基丙醛等化合物是海虾酱的特征挥发性化合物。石月等[41]通过GC-IMS对鱼骨泥及酶解液进行风味分析，共检测出29 种风味物质。鱼骨泥中主要挥发性风味物质是醛类和酮类，而酶解液中主要呈味物质为酮类和酯类，挥发性风味物质的种类及含量差异明显。本研究在两组发酵液中共检测出48 种风味物质。其中，未经超声处理组的发酵液醛类物质阈值较低，这是发酵液在发酵过程中脂质氧化造成的[42]。一般来说，饱和直链醛具有令人不愉快的气味，容易给发酵液的风味造成负面影响。相比之下，经超声辅助处理组的发酵液醛类物质阈值升高，发酵产物中醇类、酮类、酯类物质种类明显增加，说明超声处理能提高酶解液脂质抗氧化能力，这与Meng Xiangyong等[43]的研究结果一致。

发酵产物中的游离氨基酸对鲜味有很大的贡献，可以与其他组成成分相互作用改善产物的风味，也是评价发酵产物的重要营养指标[44]。发酵12 d后,与未超声处理组相比，超声处理组的发酵产物中游离氨基酸总量增多，鲜味氨基酸Ala、Glu含量也明显增加，使得发酵产物的鲜味更加醇厚，品质得到了明显的提升。另外，一些具有抗氧化能力的氨基酸如His、Tyr、Cys-s等含量均有明显的提高，有利于抑制发酵过程中油脂的氧化，提高发酵液的风味。

综上所述，经超声处理的鲐鱼酶解液发酵产物香味浓郁、营养价值较高，可作为海鲜调味品的基料使用，有利于大幅度提高鲐鱼酶解液的附加值。

4 结论

本研究通过考察菌落数、氨基酸态氮含量、感官评价、电子鼻信息PCA结果、游离氨基酸含量以及GC-IMS等指标，探究了超声技术对发酵产物风味品质的影响。结果表明，在发酵过程中，同一发酵时间下，超声处理组发酵产物的菌落数、感官评分与氨基酸态氮含量均高于未超声处理组，且鲜香味浓郁、风味品质较好。经12 d发酵后，超声处理组中发酵产物的EAAI为82.90，营养品质较高。GC-IMS分析结果表明，与未超声处理组相比，超声处理组中不饱和醇类、酮类等香气活性物质含量提高，而饱和直链醛等具有不良风味的物质含量降低。但本研究仅探究了超声辅助处理对发酵鲐鱼酶解液风味品质的影响，下一步还需重点研究超声催化鲐鱼发酵液风味化合物形成的机制。