吴跃,陈中,阳婉容,黄淑玲

作者单位： 523000 广东省东莞市,广州中医药大学东莞医院内分泌科

近年来,我国糖尿病发病率呈逐年上升趋势。《中国2型糖尿病防治指南(2020版)》显示,我国糖尿病发病率已达11.2%。胰岛素抵抗(IR)是2型糖尿病的主要特征和重要致病机制,除此之外,IR还可以导致超重或肥胖、高血压、高脂血症、代谢综合征及多囊卵巢综合征等多种疾病。中医药治疗糖尿病具有独特的优势,不仅能够降低患者的血糖水平,还能改善IR,并且没有明显不良反应。中医学将IR归入“消渴”“消瘅”“脾瘅”等范畴。消瘅片是东莞市名中医黄淑玲教授经验方,主要用于气滞痰阻血瘀型糖尿病早期患者。临床研究表明,消瘅片可以明显改善患者IR[1]。网络药理学是基于生物信息学、药理学、网络拓扑分析等学科融合的方法。中医学认为,人与自然界是一个统一整体,形成了“天人合一”的系统性调控理论,而网络药理学通过构建“药物—靶点—疾病”网络,探讨网络各节点生物功能与疾病的互相作用关系,这与中医的整体观是一致的[2]。本研究利用网络药理学方法,对消瘅片的有效成分进行筛选,预测其改善IR的相关靶点及通路,证实其临床疗效,并为深入开展有关研究工作提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 消瘅片的活性成分及靶点筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)对消瘅片的8味药(莱菔子、郁金、玄参、牡丹皮、大黄、川贝母、桃仁、丹参)进行检索。由于是复方成分,化合物较多,故以口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18作为标准筛选有效成分及对应的靶标蛋白,然后利用UniProt在线数据库逐一查找靶标蛋白对应的靶点基因。

1.2 消瘅片治疗IR潜在靶点的预测 登录GeneCards数据库,查找并下载与IR相关的靶点,查找关键词为“insulin resistance”。将消瘅片和IR各自靶点输入网络工具Venny 2.1内,绘制韦恩图,取相交靶点,获得消瘅片改善IR的潜在靶点。

1.3 消瘅片治疗IR的关键活性成分预测 用Cytoscape软件构建“药物—成分—共同靶点”网络图,通过Network Analyzer工具对药物有效成分进行分析,选取连接度(Degree值)较大的作为消瘅片改善IR的关键活性成分。

1.4 蛋白相互作用网络的构建 将1.2项下的交集靶点输入STRING数据库,生物种类限定为“Homo Sapiens”,构建PPI网络,数据保存为TSV格式,之后将数据导入Cytoscape软件中进行可视化展示。

1.5 基因富集分析 使用R语言软件中的数据包和相关函数将1.2项得到的潜在作用靶点转换为基因ID,然后进行GO功能富集分析和KEGG富集分析。

2 结 果

2.1 消瘅片的活性成分及其作用靶点 根据筛选标准在TCMSP中检索获取药物活性成分,其中莱菔子2种,郁金3种,玄参5种,牡丹皮6种,大黄10种,川贝母10种,桃仁19种,丹参59种,其中共有成分有3种。去重后得到106种活性成分,共作用于266个靶点,见表1。

表1 消瘅片的主要活性成分

2.2 交集靶点的确定 GeneCards数据库中,与IR相关的靶点总共有9 041个,以“Relevance score≥10”作为标准,筛选出632个相关度高的靶点,与消瘅片活性成分的靶点在韦恩图中相交,得到55个交集靶点,见图1。

图1 消瘅片—IR韦恩图

2.3 活性成分—靶点网络的构建 应用Cytoscape软件绘制消瘅片药物成分和靶点的可视化网络,见图2。用Network Analyzer工具分析出Degree值排前8位的主要成分为:β-谷甾醇、槲皮素、山柰酚、木犀草素、丹参酮ⅡA、豆甾醇、柳杉酚、柚皮素。其中β-谷甾醇为川贝母、大黄、桃仁、玄参、郁金的共同成分,豆甾醇为川贝母、莱菔子、牡丹皮、玄参、郁金的共同成分,柳杉酚为丹参、玄参的共同成分。

注:八边形代表药物成分,菱形代表靶点,圆形代表中药(TR:桃仁,CBM:川贝母,LFZ:莱菔子,DS:丹参,XS:玄参,MDP:牡丹皮,DH:大黄,YJ:郁金),A、B、C分别对应共有成分β-谷甾醇、豆甾醇、柳杉酚,图形面积代表作用强度

2.4 PPI网络构建 将STRING数据库得到的数据导入Cytoscape软件构建可视化网络,得到含55个节点、544条边的PPI网络,见图3。Degree值较大的基因有白介素-6(IL-6)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(CASP3)、表皮生长因子受体(EGFR)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)转录因子、血管内皮生长因子A(VEGFA)等,表明这些靶点可能是消瘅片改善IR的关键靶点。

注:内层菱形为Degree值前10的基因,图形大小代表Degree值大小

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析 将2.2项得到的55个靶点通过R语言软件进行GO功能和KEGG富集分析。GO功能富集分析得到消瘅片1 221个生物过程(BP),主要涉及细胞对缺氧的反应、类固醇激素的调节、酮的调节、转录的调控、凋亡信号通路的调控及对电解质、体液调控,见图4。KEGG通路富集分析得到130条,消瘅片主要调控脂质和动脉粥样硬化(Lipid and atherosclerosis)、多种癌症(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Chemical carcinogenesis-receptor activation、Colorectal cancer、Prostate cancer、Proteoglycans in cancer、Breast cancer)、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物—糖基化终末产物受体(AGE-RAGE)、缺氧诱导因子-1(HIF-1 signaling pathway)、PI3K-Akt、肿瘤坏死因子(TNF signaling pathway)、乙型肝炎(hepatitis B)、酒精性肝病(Alcoholic liver disease)、内分泌抗性(Endocrine resistance)、IR(insulin resistance)等信号通路,见图5。

注:图中展示了P值及富集基因数排前20位的条目

注:图中展示了P值及富集基因数排前20位的条目

3 讨 论

从“药物—成分—共同靶点”的互作网络图中可以看出,槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素均是消瘅片有效的活性成分,这些化合物均是黄酮类化合物,均可以有效地清除氧自由基,降低脂质过氧化,调节脂质代谢,减弱α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性,调节有关基因蛋白的表达,提升胰岛素敏感性,使其达到抗IR作用。甾醇类成分中,豆甾醇等植物类甾醇可以通过降低胆固醇和三酰甘油达到降低血脂的目的,从而改善IR,延缓2型糖尿病的进展[3];β-谷甾醇通过调节IRS-1/AKT介导的胰岛素信号途径,发挥降脂、抗氧化、抗炎、调节葡萄糖吸收作用,缓解IR。尤一萍[4]通过临床试验证明,丹参酮ⅡA可降低脂联素,减轻炎性反应,促进血管内皮细胞功能恢复,从而改善患者血循环及IR。

GO功能富集分析结果显示,消瘅片与BP相关的主要集中在细胞对缺氧的反应、类固醇激素的调节、转录的调控、凋亡信号通路的调控及对电解质、体液调控的反应上,表明在肥胖缺氧、高酮、离子紊乱、脱水状态下,炎性因子表达增加,诱导IR,此外,类固醇激素升高,拮抗胰岛素,也会降低胰岛素敏感性。

KEGG富集分析结果显示,消瘅片主要调控脂质和动脉粥样硬化、多种癌症、乙型肝炎、内分泌抗性、IR、糖尿病并发症中的AGE-RAGE、缺氧诱导因子-1、PI3K-Akt、肿瘤坏死因子、酒精性肝病等信号通路,大部分通路存在互相关联、协同作用的关系。

KEGG富集分析结果显示,消瘅片有效活性成分的作用靶标与多种癌症相关。有研究表明,IR与多种常见癌症发生风险的增加有关[5],可能机制是通过肿瘤坏死因子、缺氧诱导因子-1、PI3K-Akt等信号通路来发挥改善IR的作用。

肥胖和IR经常伴随着炎性递质的显著增加,体现了IR和动脉粥样硬化之间存在联系。动脉粥样硬化在许多方面类似于炎症状态,具有显著的炎性细胞浸润和炎性递质表达,目前已知脂肪组织可以动态产生多种炎性递质,如肿瘤坏死因子-α、白介素-1、白介素-6等。大量研究表明,这些炎性递质使IR表型永久化,并对血管系统造成有害影响[6]。IR中可能与血管疾病临床相关的两个主要信号通路涉及核因子-κB(NF-κB)和c-Jun N-末端激酶(JNK)。

有研究表明,糖尿病患者晚期糖基化终末产物(AGEs)在体内积聚所诱发的炎性反应既可以引发IR,又导致胰岛素β细胞凋亡增加和功能减退。内源性AGEs能促进体内氧化应激,刺激炎症发生的蛋白质、脂质或核酸等大分子物质的糖化产物。AGEs-RAGE介导的病理过程的启动涵盖了丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB等多种导致氧化应激的信号转导途径。MAPK的活化促进了细胞的增殖和浸润,而NF-κB的活化则会造成大量促炎细胞因子的表达和释放,如IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等,从而造成慢性细胞活化效应和组织损伤,进而参与胰岛细胞功能受损的发病机制。冯燕等[7]研究表明,AGEs与IR呈正相关,AGEs是IR的重要危险因素,表明在2型糖尿病初期,AGEs能诱导氧化应激,释放炎性因子,使体内各种应激酶活性增加,这些激酶能使蛋白分子在胰岛素作用通路上发生磷酸化改变,从而形成IR。

PI3K-Akt信号通路参与了负责储存能量的白色脂肪组织向负责产热耗能的褐色脂肪组织的转变过程,产能过程中需要消耗葡萄糖和脂质成分,进而改善IR。脂肪组织还会在低氧环境下释放IL-6、TNF-α等炎性因子,激活脂肪细胞内HIF-1α以及其调控的低氧反应相关通路,导致胰岛素敏感性下降、血糖升高,进而发生慢性炎症及IR。

李婷等[8]通过对代谢综合征的患者观察研究发现,HBV感染组的空腹血糖、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)高于非感染组,表明HBV感染可能与IR有关。长时间大量饮酒后,乙醇会对细胞中的IRS1/2、PI3K、AKT等蛋白的表达或磷酸化造成干扰[9],同时,饮酒还能引起体内的炎性因子在肝细胞中激活细胞因子信号传导抑制因子(SOCSs)的表达,过量的SOCSs可以与胰岛素受体或IRS-1结合[10],抑制IRS-1/PI3K/AKT途径的激活,减少肝细胞对胰岛素的敏感程度,进而产生肝IR。

综上所述,本研究通过网络药理学与生物信息学分析了消瘅片改善IR的作用机制,结果显示其具有多靶点和多通路的特点,为临床中使用消瘅片改善IR提供了理论依据。但不可否认的是,网络药理学存在一定的局限性,如缺乏中药在制剂中发生一系列复杂变化的研究数据,忽略了药物剂量问题,不同的数据处理方法对结果的影响等。后续仍需完善试验研究,对消瘅片改善IR的具体作用机制加以明确。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突。