王丹丹,孙 丽,于 宏,崔世宇,庞诗琪,解志红

(山东农业大学资源与环境学院,山东泰安 271000)

大豆是我国主要的油料作物之一,也是重要的粮食作物,但随着大豆连续种植年限的增加及不合理轮作制度,使大豆连作障碍问题成为制约我国大豆产业的重要因子[1-2],如何有效缓解大豆连作障碍,提高大豆的产量与品质,成为我国大豆产业急需解决的问题。连作障碍会降低大豆对营养元素的吸收能力,影响大豆各个时期的正常生长,同时还会引起植物病害加重,最终降低大豆的产量和品质[3-5]。大豆连作障碍是植物与土壤2个系统多个因素综合作用引起的,其中一个重要原因是土壤中自毒物质的积累[6-7]。自毒作用是化感作用的一种特殊形式,即作物分泌的化感物质在土壤中积累,会抑制同茬或下茬的同种或同科作物的生长发育[8]。酚酸类化感物质常被认为是根系分泌物中主要的自毒化感物质[9-10],大豆根系分泌物中常见的酚酸类自毒化感物质有对羟基苯甲酸、香草酸等[9,11-12],其中对羟基苯甲酸(p-Hydroxybenzoic acid,PHBA)能影响根系细胞线粒体正常功能,导致活性氧积累,从而影响植物根系的正常生长[13-14],也会造成植物无法正常利用光合作用吸收的能量,影响植株正常生长[15];对羟基苯甲酸还会损伤根系细胞,破坏根系的完整性,使土传病原菌更易从植物根系入侵,引起植物病害蔓延[16-17];此外,对羟基苯甲酸的积累导致连作土壤理化性质恶化,不利于作物对养分的利用[18-19]。

土壤中自毒化感物质酚酸的积累是导致连作障碍的一个重要原因,有效实现酚酸安全降解进而有效缓解连作障碍是大豆产业的重要发展方向。根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)是指附着于根际土壤颗粒中,对植物健康生长发挥着重要作用的一类根际微生物[20],根际促生菌具有降解自毒化感物质、抑制有害植物病原菌生长、促进植物生长、增加土壤微生物群落中有益微生物数量、对环境无污染的特点,在连作障碍治理中应用广泛[19,21]。在大豆连作障碍土壤中接种有酚酸降解功能的根际促生菌,利用微生物分解连作土壤中累积的自毒化感物质,有望成为一项健康有效的治理措施。目前,利用选择培养基从自然环境中已筛选获得多种具有对羟基苯甲酸降解功能的根际促生菌,包括假单胞菌属(Pseudomonassp.)[19]、不动杆菌属(Acinetobactersp.)[21]、克雷伯氏菌属(Klebsiellasp.)[22]等,这些微生物可以高效降解对羟基苯甲酸且降解底物多样,在缓解连作障碍中具有较好的实际应用价值[23]。利用根际促生菌治理大豆连作障碍可持续性强且对生态环境友好,而寻找有效的可以使用的多功能根际促生菌是生物治理实施的前提,因此,该研究从连作5年的大豆根际土壤中以对羟基苯甲酸为唯一碳源筛选降解菌株,并测定其对大豆发芽及幼苗生长的影响,为生物治理大豆连作障碍提供可利用根际促生菌菌株。

1 材料与方法

1.1 供试土壤样品取自吉林省延边朝鲜族自治州5年连续大豆种植地,将大豆植株根部挖出,抖落大块附着土,根系1 cm内的根际土收集后置于4 ℃保存运输。

1.2 培养基、主要试剂和仪器LB培养基(蛋白胨 10 g/L,酵母粉 5 g/L,NaCl 10 g/L)、无机盐培养基(KH2PO42 g/L,Na2HPO41.3 g/L,(NH4)2SO42 g/L,NaCl 5 g/L,葡萄糖1 g/L)。基因组提取试剂盒,购自Axygen生物技术(杭州)有限公司;16S扩增引物,购自TaKaRa生物技术(大连)有限公司;高保真聚合酶Primes STAR HS DNA polymerase,购自TaKaRa生物技术(大连)有限公司。

1.3 对羟基苯甲酸高效降解菌的分离从连续种植5年的大豆耕地中选取长势较好的植株,采集根际土壤,按1%质量体积比将土壤接种于1 g/L对羟基苯甲酸的无机盐培养基中,35 ℃摇床180 r/min,使能够降解对羟基苯甲酸的菌株得到富集。土壤悬液在摇床中培养10 d后稀释涂布于LB培养基上,35 ℃培养12 h。挑取单菌落划线于LB固体培养基上,35 ℃培养12 h后观察菌落特征,若培养特征完全一致则为同一种菌,否则需多次划线反复纯化直至菌落特征一致。

1.4 高效降解菌株筛选及其耐受性测定为获得高效降解菌株,将无机盐培养基中对羟基苯甲酸浓度提高至5 g/L。将-80 ℃甘油管菌种于LB固体培养基上活化,35 ℃培养12 h,挑取单菌落接种于LB液体培养基中,35 ℃、180 r/min培养12 h即为种子液。种子液按1%的接种量转接至新LB液体培养基中,35 ℃、180 r/min振荡培养至OD600=0.5,取1 mL菌液加至49 mL无机盐培养液中,35 ℃、180 r/min培养观察菌株是否可以生长。

将筛选到的高效降解菌株再接种到对羟基苯甲酸浓度为10、15、20、25、30 g/L无机盐培养基中,35 ℃、180 r/min培养观察菌株生长情况。

1.5 自毒物质降解率测定高效降解菌株菌液(培养方法见“1.3”)接种至49 mL无机盐培养液中(对照加入1 mL无菌水),培养液中以不同酚酸自毒物质为唯一碳源,浓度为5 g/L,35 ℃摇床培养72 h,8 000 r/min离心10 min,采用紫外可见分光光度法,取上清液测定对应自毒物质的最大吸收峰波长的吸光度,并计算降解率。各物质的测定吸收波长分别为对羟基苯甲酸246 nm、苯甲酸230 nm、香草酸250 nm。降解率=(对照吸光度-处理后样品吸光度)/对照吸光度×100%。

1.6 根际促生菌菌株鉴定提取根际促生菌基因组DNA,扩增16S rRNA序列片段,扩增引物为27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)、1429R(TACGGYTACCTTGTTACGACTT)。

电泳检测产物片段后送至测序公司测序,16S rRNA序列片段在EZBioCloud网站上进行序列同源性比对分析。

1.7 根际促生菌促生能力测定固氮能力测定采用Ashby无氮固体培养基,将目标根际促生菌接种于Ashby无氮固体培养基上,35 ℃培养7 d,记录菌株的长势。

解磷能力测定采用无机磷固体培养基和卵黄固体培养基,将目标根际促生菌分别接种于无机磷固体培养基和卵黄固体培养基上,35 ℃培养3 d,观察是否有溶磷圈出现。

IAA合生能力测定采用Salkowski法,将目标根际促生菌接种于含L-色氨酸(200 mg/L)的LB液体培养基中,35 ℃、170 r/min摇床培养4 d,菌液于4 ℃、8 000 r/min条件下离心10 min,取上清液于酶标板中,加入等体积Salkowski比色液,黑暗条件下静置反应30 min后,迅速于530 nm下测定吸光度。

1.8 种子发芽试验根际促生菌促进种子萌发试验以大豆为试验对象,大豆浸泡于70%乙醇10 min后用无菌水清洗3遍完成消毒。CK为空白对照,消毒后的大豆种子置于含无菌水的培养皿中;处理T1为消毒后的种子置于根际促生菌菌液中(细菌在OD600为0.5时离心收集菌体,菌体用无菌水清洗3次后重悬,接种量为1%)。每个处理10粒种子,设置5次重复。

1.9 盆栽试验盆栽土壤取自吉林省延吉市5年连续大豆种植地块,121 ℃灭菌20 min,重复灭菌2次后自然风干,土壤、蛭石、珍珠岩按3∶1∶1体积比混匀,拌入无菌MS营养液到达湿润状态,分装至盆栽盆中,每杯约200 g。大豆种子70%乙醇浸泡10 min,无菌水清洗3遍后在无菌水中浸泡12 h,放入培养基质中。CK为空白对照,消毒后的大豆种子置于固体基质中;处理T1则加入根际促生菌菌液,将活化好的菌株菌液统一调节 OD600为0.5,每杯加入500 μL菌液,每组重复5次。培养30 d后小心从培养基质中取出完整的大豆植株,将根部冲洗干净后测量植株的根长、苗高、鲜重、干重。

1.10 数据处理及分析利用Microsoft Excel和Origin 9.1软件进行数据分析及图表制作。

2 结果与分析

2.1 对羟基苯甲酸高效降解菌的筛选以对羟基苯甲酸为唯一碳源的选择培养基,在大豆根际土壤中共计分离得到42株可降解利用对羟基苯甲酸的根际促生菌株。将无机盐培养基中对羟基苯甲酸的浓度提高至5 g/L,获得6株在高浓度对羟基苯甲酸培养基中可正常生长的根际微生物,分别为PA08、PA11、PA14、PA17、PA18、PA40。通过提高无机盐培养基中对羟基苯甲酸浓度,探究所筛6株根际促生菌对对羟基苯甲酸耐受性,试验结果表明,PA18和PA40对对羟基苯甲酸的最大耐受浓度为15 g/L,PA11、PA14的最大耐受浓度为20 g/L,PA08、PA17的最大耐受浓度为25 g/L。

2.2 高效降解菌降解底物多样性的测定利用底物广谱试验探究所筛的6株根际促生菌对3种大豆常见的酚酸类自毒化感物质(对羟基苯甲酸、苯甲酸、香草酸)的降解效果,试验结果如图1所示。从图1可以看出,6株高效降解菌对3种酚酸都有降解能力,其中PA08、PA11、PA17对对羟基苯甲酸、苯甲酸、香草酸的降解效率均超过50%。

图1 6株根际促生菌酚酸降解率Fig.1 The degradation rates of phenolic acids by 6 plant growth-promoting rhizobacteria

2.3 酚酸高效降解菌的鉴定对分离筛选得到的6株高效降解菌株的16S rRNA基因序列通过NCBI数据库完成分子生物学鉴定,其结果如表1所示。从表1可以看到,6株高效降解菌株与其相似菌的相似度均超过99%,分别为无色杆菌PA08 (AchromobactermucicolensPA08)、布鲁氏杆菌PA11 (BrucellaciceriPA11)、假单胞菌PA14 (PseudomonasalloputidaPA14)、假单胞菌PA17 (PseudomonashunanensisPA17)、布鲁氏杆菌PA18 (BrucellaciceriPA18)、无色杆菌PA40 (AchromobactermucicolensPA40)。

表1 菌株的分类

2.4PseudomonashunanensisPA17促生特性分析高效降解菌AchromobactermucicolensPA08、BrucellaciceriPA11、PseudomonashunanensisPA17对大豆常见3种酚酸类自毒化感物质降解率均超过50%,但无色杆菌根据NY/T1109菌株生物安全标准为生物安全三级,而布鲁氏杆菌安全未分类,在农业生产实际应用中仍需要进一步进行致病性分析,因此选取PseudomonashunanensisPA17进行促生特征分析。

定量检测PseudomonashunanensisPA17的产IAA能力,结果如图2A所示,PA17在含L-色氨酸的LB液体培养基中培养4 d后,与Salkowski比色液反应后呈现粉红色,表明PA17可以合成植物激素IAA,合成量可以达到(8.65±0.26) mg/L。定性检测PseudomonashunanensisPA17固氮及解磷能力,PA17在Ashby无氮固体培养基上可正常生长(图2B),并且在无机磷(图2C)和有机磷(图2D)固体培养基上有明显解磷圈,表明PA17具有固氮和解磷能力。

注:A.IAA合成能力;B.固氮能力;C.解无机磷能力;D.解有机磷能力。Note:A.IAA production.B.Nitrogen fixation.C.Inorganic phosphorus solution.D.Organic phosphorus solution.图2 Pseudomonas hunanensis PA17促生特征分析Fig.2 Promoting growth feature test of Pseudomonas hunanensis PA17

2.5PseudomonashunanensisPA17对大豆种子的促生作用测定大豆种子在不同处理下发芽率,结果表明,置于PseudomonashunanensisPA17菌液中的大豆种子发芽率(100%)明显高于CK(80%),此外,PA17明显促进大豆胚根的生长(图3)。

图3 Pseudomonas hunanensis PA17对大豆胚根生长的影响Fig.3 Effects of strain Pseudomonas hunanensis PA17 on root development of soybean

2.6PseudomonashunanensisPA17对大豆幼苗生长的影响幼苗盆栽试验结果如图4和表2所示,盆栽基质中添加根际促生菌PseudomonashunanensisPA17对大豆幼苗的鲜重、干重、株高、根长有明显的促进作用,相比于CK,PA17处理后鲜重增加11.20%,干重增加6.92%,地上部分苗高增加14.62%,地下部分根长增加25.27%。

表2 Pseudomonas hunanensis PA17对大豆幼苗生长的影响

图4 大豆盆栽试验Fig.4 Soybean pot experiment

3 讨论

对羟基苯甲酸是大豆连作障碍土壤中积累的主要自毒化感物质之一,对植物多方面造成威胁,严重影响大豆植株的健康生长。该研究从大豆连作根际土壤中筛选获得多株对羟基苯甲酸高效降解根际促生菌,其中假单胞菌PA17 (PseudomonashunanensisPA17)不仅耐受性强且降解底物多样,对对羟基苯甲酸、苯甲酸、香草酸的降解效率均已超过50%;发芽及盆栽试验结果表明,PA17可显著促进种子发芽、胚根及幼苗生长,具有较好的应用前景。

随着国家大豆产业振兴计划的实施,大豆种植面积逐步增加,如何实现减少农药化肥施用,有效缓解连作障碍,提高大豆产量和质量是产业可持续发展的重要方向。根际微生物在根表[24]或根内[25]定殖,通过多种途径直接或间接促进植物健康生长,如降解自毒化感物质[10],合成多种活性物质有效抑制植物病原菌生长[26],提高土壤中可利用养分的含量[27],产生植物类激素[28]。该研究中分离纯化到的大豆根际促生菌可有效降解自毒化感物质,并且盆栽试验明显证明其可促进大豆幼苗生长,同时选取了4株常见的植物病原真菌与一株植物病原细菌进行了植物病原菌拮抗试验,但结果显示该研究分离到的根际促生菌均没有拮抗植物病原菌能力,因此,该研究后续将针对植物病原菌拮抗能力筛选根际促生菌,将多种根际促生菌配合使用,获得多功能复合菌剂,并验证其对大豆及其他作物连作障碍缓解能力,如花生、黄瓜、番茄等,扩大复合菌剂应用范围。

4 结论

该研究针对大豆连作土壤中自毒化感物质降解菌,利用对羟基苯甲酸为唯一碳源,筛选具有对羟基苯甲酸降解及利用能力的根际促生菌,其中假单胞菌PA17不仅降解能力强且降解底物多样;促生试验表明,PA17具有吲哚乙酸合成能力、固氮能力,同时具有解有机磷及无机磷的能力;发芽试验证明PA17可促进大豆种子的萌发,并可显著促进大豆胚根的发育;盆栽试验表明PA17也可明显促进大豆幼苗的生长,具有较好的应用前景。