井一淑,吴 丹,燕 茹,潘 璐,马学平,马 鑫,万富鑫 ,刘姝靖 ,苏秀丽 ,杜 欢 ,王 琴*

(1.宁夏医科大学临床医学院,宁夏 银川 750004;2.宁夏医科大学总医院心脏中心功能检查部, 3.心内科,宁夏 银川 750004)

肥胖患者体内各种内源性危险信号可激活NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白 3(NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3, NLRP3)炎症小体而生成白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)等,促进炎症反应并造成组织损伤[1]。皮质抑素为环状神经肽,具有强大的抗炎作用[2-5]。超声生物显微镜(ultrasound biomicroscopy, UBM)是一种新型高频超声检查仪,可较精确地评估小动物心脏结构及功能。本研究采用UBM观察应变技术检测肥胖小鼠心肌损伤,以及皮质抑素减轻该损伤的价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取48只6周龄雄性C57BL/6小鼠,体质量20～30 g[实验动物使用许可证号:SCXK(宁)2020-0001],适应性饲养1周后开始实验。本实验获宁夏医科大学实验动物伦理委员会批准(IACUC-NYLAC-2022-044)。

1.2 主要试剂及仪器 皮质抑素-14(MCE,HY-P1932),NLRP3 抗体(Abmart,T55651),半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1, Caspase-1)抗体(Abmart,M025280S);小鼠白细胞介素-1β(IL-1β)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒(Abmart,AB-J0247B);UBM(VisualSonics,Vevo2100),荧光显微镜(Olympus,BX43)及透射电镜(Hitachi,H7650)。

1.4 UBM检测 以2%异氟烷麻醉小鼠,胸部脱毛、备皮后保定于检查台,控制其心率为400～500次/分[6]。采用UBM配置的MS-400探头(频率30 MHz,带宽18～38 MHz,纵向及横向分辨率分别为50及110 μm)进行扫查,获得室间隔舒张末期厚度(interventricular septal thickness at end-diastolic, IVSD)、室间隔收缩末期厚度(interventricular septal thickness at end-systolic, IVSS)、左心室后壁舒张末期厚度(left ventricular posterior wall end-diastolic thickness, LVPWD)、左心室后壁收缩末期厚度(left ventricular posterior wall end-systolic thickness, LVPWS)、左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter, LVEDD)、左心室收缩末期内径(left ventricular end-systolic diameter, LVESD)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)、二尖瓣口舒张早期血流速度(mitral early diastolic velocity, E)及舒张晚期血流速度(mitral lately diastolic velocity, A),并计算E/A。采用应变技术定量分析软件(VisualSonics,Vevo LAB 5.5.0)分别于左心室长轴切面和乳头肌左心室短轴切面描记心内、外膜,获取左心室心肌整体纵向应变、整体径向应变及整体圆周应变参数。以上参数均由同一医师(医师1)进行测量,取连续3个心动周期的平均值作为结果;之后随机选取10只小鼠,间隔2周后分别由医师1及另一医师(医师2)进行测量,将结果用于重复性检验。

1.5 透射电镜观察 麻醉状态下以颈椎脱臼法处死小鼠,分离心脏后取左心室前壁心肌1 mm×1 mm×3 mm制成超薄切片,以透射电镜观察心肌超微结构。

1.6 免疫荧光染色 将小鼠心肌组织制成石蜡切片,经脱蜡、0.5%Triton-100孵育、过氧化氢阻断内源性过氧化物酶、抗原修复、血清封闭、一抗(1∶100)、二抗(1∶100)、麦胚凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)(1∶250)及DAPI封片拍照后观察其NLRP3、Caspase-1炎症因子表达水平,并以ImageJ软件定量评估平均荧光强度。

1.7 检测IL-1β 于处死小鼠前摘眼球取血,室温下静置1 h后以3 000 r/min离心10 min,取上清液;采用ELISA试剂盒检测小鼠血清IL-1β表达水平。

1.8 统计学分析 采用SPSS 26.0统计分析软件。以±s表示正态分布的计量资料,采用单因素方差分析及LSD-t检验进行多组间及两组间比较。以组内相关系数(intra-class correlation coefficient, ICC)评价观察者间及观察者内一致性:ICC>0.75为一致性好。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

肥胖组12只、皮质抑素组10只小鼠造模成功。

2.1 常规心脏超声参数 3组小鼠常规心脏超声参数差异均无统计学意义(P均>0.05),见表1。

表1 肥胖组、皮质抑素组及正常组小鼠常规心脏超声指标比较

2.2 心脏应变参数 3组小鼠心脏应变参数差异均有统计学意义(P均<0.05)。相比正常组及皮质抑素组,肥胖组小鼠整体纵向、径向及圆周应变均减低(P均<0.05)。见图1及表2。

图1 小鼠心脏应变超声图像 A.肥胖组整体纵向应变; B.皮质抑素组整体纵向应变; C.正常组整体纵向应变; D.肥胖组整体圆周应变; E.皮质抑素组整体圆周应变; F.正常组整体圆周应变

表2 肥胖组、皮质抑素组及正常组小鼠心脏应变指标比较

2.3 透射电镜 肥胖组小鼠心肌内见大量脂滴,肌原纤维排列不整齐,局部断裂溶解,线粒体增生、聚集成团;皮质抑素组肌原纤维排列尚整齐,未见局部断裂溶解,线粒体数量结构正常;正常组肌原纤维排列整齐,肌节Z线清晰平直,线粒体数量结构正常。见图2。

图2 小鼠心肌透射电镜图 A.肥胖组; B.皮质抑素组; C.正常组 (上排放大倍数为×5 000,下排为×20 000;N:细胞核,Mi:线粒体,Mf:肌原纤维,箭:脂滴,*:肌原纤维局部断裂溶解)

2.4 免疫荧光染色 肥胖组小鼠心肌内NLRP3、Caspase-1炎症因子表达均高于皮质抑素组及正常组(P均<0.05)。见图3。

2.5 IL-1β水平 肥胖组、皮质抑素组及正常组小鼠血清IL-1β水平分别为(8.49±1.43)pg/ml、(6.64±1.52)pg/ml及(5.28±1.46)pg/ml,3组间差异有统计学意义(F=7.17,P=0.01);肥胖组IL-1β水平高于皮质抑素组和正常组(P均<0.05)。

2.6 重复性检验 观察者间及观察者内测量整体纵向应变、整体径向应变及整体圆周应变结果的一致性均好(ICC均>0.75)。

3 讨论

NLRP3炎症小体由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)和前Caspase-1(pro-Caspase-1)组成,可通过促进免疫/炎症反应,介导细胞凋亡和坏死、心肌纤维化、心肌血管重塑等,降低心脏收缩和舒张功能[7-8]。肥胖患者体内存在多种内源性危险信号,可激活NLRP3炎症小体,切割生成具有活性的IL-1β等,促进炎症反应[9]。干预 NLRP3炎症小体激活可能为防治肥胖人群心肌损伤的新靶点。

皮质抑素是生长抑素家族中的环状神经肽类物质,在关节炎、炎症性肠病、肺炎和脓毒症等中发挥强大抗炎作用[2-5];同时,作为新型心血管保护肽,对多种心血管疾病具有重要保护作用[10]。

UBM可实时、清晰显示小动物心脏及大血管等结构,并进行精确测量及多样数据后处理。心肌应变指心肌组织在单位时间内相对于其原始形状的变形程度,是UBM检测心肌功能的新指标。斑点追踪应变技术的优势在于无角度依赖性、可进行分层或节段心肌功能评估[11],较常规超声更为灵敏[12-13]。利用应变定量分析软件对UBM图像进行后处理,以斑点追踪技术追踪心肌组织内微小回声斑点的运动,可获得应变等力学参数。本团队前期研究[14-15]已证实应变技术对检出肥胖小鼠早期心肌损伤具有重要意义。本研究3组小鼠常规超声指标差异均无统计学意义,而肥胖组整体纵向应变、整体径向应变及整体圆周应变均较其他2组减低,且电镜结果进一步证实肥胖组小鼠心肌存在超微结构损害,提示应变技术能较常规超声更敏感地发现左心室心肌损伤,与ZHANG等[16-17]的结果一致。

同时,本研究中,相比肥胖组,皮质抑素组小鼠心肌超微结构损伤得到明显改善,整体应变参数亦高于肥胖组,表明皮质抑素对于心肌损伤具有保护作用。ZHANG等[18]研究表明,皮质抑素可消除脓毒症对NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表达激活的影响,抑制IL-1β释放,从而减轻心肌损伤。本研究亦发现皮质抑素可抑制肥胖对NLRP3和Caspase-1表达激活的影响及IL-1β释放,提示皮质抑素对肥胖小鼠的心肌保护作用与其抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β有关。

综上,UBM应变技术可有效检出肥胖小鼠早期心肌损伤,而皮质抑素能减轻该损伤。本研究未设立不同皮质抑素浓度梯度组以深入探讨皮质抑素的抗炎作用,有待后续加以完善。