胡 雨，麻雨乐，郭志俊，高 波

（华润三九现代中药制药有限公司，广东 惠州 516000）

枇杷叶为蔷薇科植物枇杷［Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.］的干燥叶，始载于《名医别录》，具有清肺止咳、降逆止呕的作用，可用于治疗肺热咳嗽、气逆喘急、胃热呕逆、烦热口渴等病症［1］。熊果酸和总三萜酸是其主要的抗炎和止咳作用成分［2］。枇杷叶主要有蜜炙、姜炙等炮制方法，临床常用的炮制品为蜜枇杷叶，其采用蜜炙法进行加工炮制［3］。枇杷叶蜜炙以后清肺止咳、降逆止呕功能增强［4］。《中华人民共和国药典（2020 年版）》描述的蜜枇杷叶炮制工艺缺少可控的工艺参数［1］，关于蜜枇杷叶炮制工艺研究的文献较少［5，6］，且主要以熊果酸、齐墩果酸为评价指标，缺少对蜜枇杷叶的浸出物及标准汤剂出膏率进行评价。本研究以齐墩果酸和熊果酸总量、浸出物及标准汤剂出膏率为综合评价指标，采用正交设计［7］，考察闷润时间、蜜水比、炒制温度及炒制时间4 个因素，优选蜜枇杷叶的加工炮制工艺，以期为蜜枇杷叶的扩大生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

高效液相色谱仪色谱系统，包括四元梯度输液泵、色谱柱温箱、二极管阵列紫外检测器、Chromeleon 7 色谱管理系统；C18 色谱柱、超声清洗仪、粉碎机等。

1.2 试剂

枇杷叶（批号：2009001）购于亳州某饮片公司；齐墩果酸（批号：110709-201206，纯度为94.9%）、熊果酸（批号：110742-201823，纯度为99.9%）购于中国食品药品检定研究院）；乙腈（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；水为娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈饮料科技有限公司）。

试验所用枇杷叶饮片，经鉴定为蔷薇科植物枇杷的干燥叶［1］。

1.3 方法

1.3.1 齐墩果酸和熊果酸总量测定 色谱条件：C18色谱柱，流动相为乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液（67∶12∶21），检测波长为210 nm；流速为1.0 mL/min ，柱温为25 ℃，进样量为10 μL。理论板数应≥5 000（以熊果酸峰计算），色谱峰对称性较好［1］。齐墩果酸对照品、熊果酸对照品的高效液相色谱见图1。

图1 蜜枇杷叶高效液相色谱

1.3.2 对照品溶液和供试品溶液的制备 取齐墩果酸对照品、熊果酸对照品适量，参照《中华人民共和国药典（2020 年版）》枇杷叶药材标准含量测定项对照品溶液、供试品溶液的方法制备［1］。

1.3.3 浸出物含量的测定 依据《中华人民共和国药典（2020 年版）》四部通则“2201 浸出物测定法”测定［1］。

1.3.4 标准汤剂出膏率的测定 根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》中关于“标准煎液”的制备制定蜜枇杷叶标准汤剂试验方案。按照蜜枇杷叶的药性及用药部位（叶类）选择煎煮参数，对加水量（倍数）的要求“煎煮开始时的用水量一般以浸过药面2～5 cm 为宜”进行考察，确定了蜜枇杷叶标准汤剂加水量及煎煮参数，药性及饮片种类为一般类/叶类，饮片量为100 g，无前处理，浸泡30 min，煎煮次数2 次，一煎加水量为饮片重量的12 倍，一煎时间30 min，二煎加水量为饮片重量的10 倍，二煎时间25 min。

1.4 正交试验

1.4.1 蜜枇杷叶工艺的正交试验设计 基于蜜枇杷叶炮制工艺文献［5，6］检索及单因素试验考察，采用L9（34）正交设计，考察闷润时间（A）、蜜水比（B）、炒制温度（C）、炒制时间（D）4 个因素，以齐墩果酸和熊果酸总量、醇溶性浸出物、标准汤剂出率为评价指标，优选蜜枇杷叶的炮制工艺。各因素和水平见表1。

表1 正交设计因素和水平

1.4.2 综合评分标准 为了更客观地评价蜜枇杷叶的质量，以蜜枇杷叶齐墩果酸和熊果酸总量、浸出物及标准汤剂出膏率为评价指标，用综合评分法评定试验［8］。齐墩果酸和熊果酸总量是《中华人民共和国药典（2020 年版）》规定的指标性成分，所以其权重系数拟定为0.5；醇溶性浸出物及标准汤剂出膏率权重系数分别为0.3 及0.2。浸出物评分=（浸出物的评分/9 个样品中最高浸出物的评分）×30；齐墩果酸和熊果酸总量的加权评分=（齐墩果酸和熊果酸总量/ 9 个样品中齐墩果酸和熊果酸总量的最高含量）×50；出膏率含量的加权评分=（出膏率含量/9 个样品中出膏率的最高含量）×20。综合评分=浸出物加权评分+齐墩果酸和熊果酸总量的加权评分+出膏率的加权评分。

1.4.3 不同工艺蜜枇杷叶标准汤剂的制备 取正交试验各工艺组合蜜枇杷叶样品约100 g，置于圆底烧瓶中，加入12 倍量水浸泡30 min，加热回流30 min，滤过；药渣再加10 倍量水，加热回流25 min，滤过，合并两次滤液，称定滤液重量［9］。

1.4.4 出膏率测定 取合并水煎液50 g，精密称定，放于已恒定重量的蒸发皿中，置于水浴锅上蒸干，放在105 ℃烘箱内干燥3 h，移至干燥器中，冷却30 min，称重，计算水煎液含固量，并根据水煎液总重量和饮片重量换算出膏率。

出膏率=固体重（g）×水煎液总重量（g）/［取样量（g）×饮片重量（g）］×100%

1.5 数据分析

采用正交设计助手Ⅱ3.1 软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 供试蜜枇杷叶的高效液相色谱

由图2 可知，供试蜜枇杷叶的高效液相色谱中，齐墩果酸和熊果酸的出峰时间分别为21.133、22.120 min，与对照样品的出峰时间相近，说明蜜枇杷叶中含有齐墩果酸和熊果酸。

图2 供试蜜枇杷叶的高效液相色谱

2.2 正交试验结果

蜜枇杷叶炮制工艺的正交试验设计［10，11］及结果见表2，方差分析结果见表3。由直观分析可知，各因素对蜜枇杷叶炮制工艺的影响大小顺序为C＞A＞B＞D。方差分析结果表明，炒制温度（C）对炮制工艺有显著影响。A、B、D因素对蜜枇杷叶炮制工艺无显著影响。因此，从直观和方差分析结果并结合实际情况进行调整得到，蜜枇杷叶的最佳炮制工艺为A2B1C2D1，即取净枇杷叶300 g，加入20%的蜂蜜（蜜∶水=3∶1，m∶m）拌匀，闷润1.0 h，置于140 ℃的炒药机中炒制15 min，取出，晾凉筛去碎屑，即可。

表2 蜜枇杷叶炮制工艺的L9（34）正交试验结果（n=3）

表3 综合评分方差分析结果

2.3 验证性试验

取枇杷叶丝500 g，按优选的蜜炙工艺制备蜜枇杷叶样品3 份，测定其齐墩果酸和熊果酸总量、浸出物及标准汤剂出膏率［12］，验证结果见表4。结果表明，采用该优选工艺蜜枇杷叶齐墩果酸和熊果酸总量、浸出物及标准汤剂出膏率均较稳定，表明该蜜炙工艺较稳定、可控。即蜜枇杷叶的最佳工艺为取干净枇杷叶丝，加入20%的蜂蜜（蜜∶水=3∶1，m∶m）拌匀，闷润1.0 h，置于140 ℃的炒药机中炒制15 min，取出，晾凉筛去碎屑，即可。

表4 验证试验结果

3 讨论

李焕平［5］优选的蜜枇杷叶工艺为取枇杷叶，加入40%炼蜜，闷润0.5 h，炒制温度（150±5）℃，炒制时间10 min。李文兵等［6］优选的工艺为取炼蜜，按1∶1的比例加入沸水稀释，加入枇杷叶丝闷润1.0 h，220 ℃炒制15 min 即可。这两种优选的工艺各不相同，本研究以齐墩果酸和熊果酸总量、浸出物及标准汤剂出膏率综合指标代替单一指标来考察和优选蜜枇杷叶的炮制工艺，结果更科学和客观。

该试验以浸出物、标准汤剂出膏率及齐墩果酸和熊果酸总量为综合优选评价指标，采用正交试验优选出的蜜枇杷叶炮制工艺稳定，重现性良好，可在一定程度上为蜜枇杷叶的工业化生产提供参考。此外，仅从浸出物、标准汤剂出膏率和指标性成分角度来优选蜜枇杷叶的工艺尚且不足，还应结合药理药效优选蜜枇杷叶工艺［13］。