张 良,毛自欣,邓 珊,严美婷

(1.江西省食品发酵研究所,江西宜春 336023;2.江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院,江西南昌 330001)

青钱柳[Cylocaryapaliurus(Batal.)Iljinskaja]为双子叶植物纲胡桃目胡桃科青钱柳属乔木植物,又名摇钱树、山麻柳、甜茶树等,是现仅存于我国的冰川四纪幸存下来的珍稀树种,广泛分布于我国南方多个省份[1-3]。据《中国中药资源志要》记载,青钱柳叶具有一定的清热、消渴、解毒、消肿等功效[4]。在民间,青钱柳叶被炮制成茶来饮用,因其茶汤口感甘甜,故被称为“甜茶”[5]。研究表明,青钱柳中含有多糖、黄酮类物质、三萜类物质等有机活性成分,以及硒、铬、钒、锗等无机营养物质[6-8]。鉴于青钱柳叶具有药食兼用的功效,青钱柳叶已被国家卫生健康委员会批准为新资源食品原料,青钱柳叶茶获得了美国食品药品管理局、日本厚生省和德国卫生部的认可[9]。而作为青钱柳主要活性成分的青钱柳多糖是目前研究的热点,其具有降血糖、降血脂、抗癌、抗氧化等功效[10-11]。

目前,多糖分离纯化的方法主要有水提醇沉法、离子交换树脂法、凝胶过滤柱色谱法、亲和色谱法等[12-14],但其存在操作复杂、耗时耗能等缺点。相对于传统的提纯方法,超滤膜分离技术具有操作条件温和、分离选择性高、不添加任何化学试剂、耗能低、成本低和节能环保等优势,适用于热敏性天然活性物质的提纯,在植物多糖的提纯方向有着较好的应用[15]。杨亚勇等[16]采用超滤和纳滤膜分离技术提取了发酵液中的阿卡波糖,最终阿卡波糖的含量高于98.8%,提取率也提高了20%(可达到62.2%);杨祖金等[17]采用卷式的超滤膜来分离提纯灵芝多糖,在6 kD超滤膜、超滤压力0.6 MPa、操作温度45～50 ℃、操作时间 45 min、提取液质量浓度 8.8 mg/mL的条件下,超滤纯化后的灵芝多糖含量为73.5%;杨宁等[18]采用10 kD的超滤膜对仙人掌多糖浸提液进行纯化浓缩,在超滤压力0.20 MPa、超滤温度 25 ℃、料液流量0.04～0.05 L/min、浓缩倍数5～7倍的最优超滤条件下,多糖得率达到了0.95%。采用超滤膜分离技术浓缩青钱柳多糖在国内还鲜有报道。该研究以江西修水县的青钱柳叶制备的青钱柳发酵液为原料[19],以超滤膜过滤时的膜通量为响应指标,首先用单因素试验及Plackett-Burman试验筛选出对响应值影响显著的因素,再进一步采用响应面试验对青钱柳多糖超滤膜浓缩的工艺进行了优化,为青钱柳多糖的综合利用提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 试材与试剂青钱柳叶,产自江西九江市修水县;发酵液,浓度5.0～6.4 g/mL,江西省食品发酵研究所;苯酚、浓硫酸,均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;无水葡萄糖标品,上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备超滤膜,采用复合膜,膜面积为1 m2,山东济南博纳有限公司生产;0.2 μm 微滤膜,山东济南博纳有限公司生产;BONA-GM-18 超滤膜设备,山东济南博纳有限公司生产;T2600 紫外可见分光光度计,青岛精诚仪器设备有限公司;HH-400 恒温水浴锅,上海兰仪实业有限公司;TG-16 高速台式离心机,苏州威尔实验设备有限公司;FA1204电子天平,上海精密科学仪器有限公司;YDJ-200B恒温摇床,英检达仪器(重庆)有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1样品的制备。样品采用刘媛洁等[19]工艺条件制备的青钱柳发酵液(多糖含量为3.34 mg/mL),在8 000 r/min条件下对发酵液进行低温离心20 min,取上清液用0.2 μm微滤膜过滤,滤过液用于超滤条件的优化。

1.3.2青钱柳多糖超滤浓缩工艺。将青钱柳发酵离心微滤液稀释一定比例后装入超滤设备。超滤开始后截留液会回到料液罐中,透过液流到滤液罐中,调节料液流量、超滤压力、超滤温度、超滤时间等超滤条件浓缩青钱柳发酵液。

1.3.3青钱柳多糖浓缩工艺优化的超滤膜选择。在超滤压力 100 kPa、超滤温度 45 ℃和超滤时间 20 min的条件下,采用 200 kD 截留分子量的超滤膜对青钱柳发酵液进行浓缩过滤,滤过液再用 100 kD 截留分子量的超滤膜进行超滤,再依次用50和10 kD 截留分子量的超滤膜对上一级滤过液进行超滤,测定超滤中每段截留分子量超滤膜的截留液和滤过液中青钱柳多糖含量占超滤前青钱柳多糖含量的比例。

1.3.4青钱柳多糖浓缩工艺优化的单因素试验。选择使用50 kD的超滤膜,固定超滤优化的单因素试验条件为料液质量浓度2.0 g/mL、料液流量20 mL/min、超滤压力120 kPa、超滤温度 40 ℃、超滤时间 20 min。

以青钱柳发酵液超滤的膜通量为评价指标,依次考察料液质量浓度(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/mL)、料液流量(10、15、20、25、30、35、40 mL/min)、超滤压力(40、60、80、100、120、140、160 kPa)、超滤温度(20、25、30、35、40、45、50 ℃)和超滤时间(5、10、15、20、25、30 min)对青钱柳发酵液超滤的膜通量的影响。

1.3.5青钱柳多糖浓缩工艺优化的响应面试验。

1.3.5.1Plackett-Burman试验设计。在单因素试验基础上,以膜通量为响应值,选取料液质量浓度(X1)、料液流量(X2)、超滤压力(X3)、超滤温度(X4)和超滤时间(X5) 共5个影响因素,采用Design-Expert 8.0.6软件设计Plackett-Burman试验来筛选出对膜通量影响显著的因素。Plackett-Burman试验设计因素及水平见表1。

表1 Plackett-Burman 试验设计因素及水平

1.3.5.2Box-Behnken试验。以Plackett-Burman试验的结果来选择对响应值膜通量(Y)影响显著的料液质量浓度(A)、超滤压力(B)和超滤时间 (C)共3个因素为自变量进行Box-Behnken试验优化,具体试验因素及水平见表2。

表2 Box-Behnken试验设计因素及水平

1.3.6分析检测。青钱柳多糖含量采用苯酚-硫酸法[19]测定。

膜通量的计算如下:

式中:J为膜通量[mL/(m2·min)];V为超滤透过液的体积(mL);S为超滤膜有效膜面积(m2) ;T为超滤时间(min)。

1.4 数据处理Plackett-Burman和Box-Behnken试验的设计采用Design-Expert 8.0.6软件,数据分析采用Design-Expert 8.0.6和SPSS 22软件。

2 结果与分析

2.1 青钱柳多糖浓缩工艺优化时超滤膜的选择从不同截留分子量超滤膜的滤液中青钱柳多糖含量占比(图1)可以看出,青钱柳发酵液中青钱柳多糖的分子量多集中在50 kD以上,用 50 kD的超滤膜浓缩青钱柳发酵液,截留的青钱柳多糖含量占比可以达到 92.98%。因此,选择50 kD的超滤膜进行青钱柳发酵液超滤浓缩工艺的优化。

图1 不同分子量截留的青钱柳多糖含量占比Fig.1 The proportion of Cyclocarya paliurus polysaccharides intercepted by different molecular weight

2.2 青钱柳多糖浓缩工艺优化的单因素试验

2.2.1料液质量浓度对膜通量的影响。由图2可知,随着料液质量浓度的增加,青钱柳多糖膜过滤的膜通量呈现逐渐减少的趋势。当膜通量的质量浓度达到2.0 g/mL以上时,膜通量下降速率明显增大。分析原因可能是随着料液质量浓度的增加,料液中更多的大分子物质更快速地聚集在超滤膜的表面,导致目标物质通过膜的阻力增加,膜通量降低较明显[20]。因此,选择最适料液质量浓度为2.0 g/mL。

图2 料液质量浓度对膜通量的影响Fig.2 Effect of liquid mass concentration on membrane flux

2.2.2料液流量对膜通量的影响。由图3可知,料液流量在10～30 mL/min时随着料液流量的增加,青钱柳多糖膜过滤的膜通量呈上升趋势;当料液流量为30 mL/min时,膜通量达最大值,为8.91 mL/(m2·min);当料液流量高于30 mL/min时,膜通量开始降低。分析原因可能是提高料液流量不能降低超滤膜的污染,反而在增加料液流量的同时,也增加了膜表面压力的损失,导致有效压力减少,膜通量也随之减少[21]。因此,选择最适料液流量为30 mL/min。

图3 料液流量对膜通量的影响Fig.3 Effect of solid-liquid flow rate on membrane flux

2.2.3超滤压力对膜通量的影响。由图4可知,膜通量在40～120 kPa时,随着膜通量的增加,青钱柳多糖膜过滤的膜通量呈现上升的趋势;当超滤压力为120 kPa时,膜通量达最大值,为7.26 mL/(m2·min)。超滤压力>120 kPa,膜通量逐渐下降。分析原因可能是大分子物质在超滤膜的表面积聚,形成凝胶层的厚度和密度均相应增加,导致超滤效率降低,膜通量降低[22]。因此选择最适超滤压力为120 kPa。

图4 超滤压力对膜通量的影响Fig.4 Effect of ultrafiltration pressure on membrane flux

2.2.4超滤温度对膜通量的影响。由图5可知,随着超滤温度的增加,膜通量也呈现出逐渐增加的趋势。当超滤温度为40 ℃时,膜通量为7.27 mL/(m2·min)。当超滤温度超过40 ℃后,膜通量增加的速率在减少。分析原因可能是超滤膜在较高温度时会发生膨胀导致膜孔径变小,同时大分子物质吸附也在增加,形成的凝胶层堵塞超滤膜孔,导致超滤速率降低,膜通量相应也会减小[23]。因此,选择最适的超滤温度为40 ℃。

图5 超滤温度对膜通量的影响Fig.5 Effect of ultrafiltration temperature on membrane flux

2.2.5超滤时间对膜通量的影响。由图6可知,随着超滤时间的增加,膜通量呈逐渐降低的趋势;当超滤时间为20 min时,膜通量为7.27 mL/(m2·min);当超滤时间超过20 min时,膜通量下降速率变小。分析原因可能是发生了料液浓度差极化现象,膜表面的大分子物质积聚形成凝胶层,膜的传质阻力增加,导致超滤膜的膜通量降低[24]。因此,选择最适的超滤时间为20 min。

图6 超滤时间对膜通量的影响Fig.6 Effect of ultrafiltration time on membrane flux

2.3 青钱柳多糖浓缩工艺优化试验

2.3.1Plackett-Burman试验。在单因素试验基础上,选取料液质量浓度(X1)、料液流量(X2)、超滤压力(X3)、超滤温度(X4)和超滤时间(X5) 共5个因素进行Plackett-Burman试验,试验设计及结果见表3,运用Design-Expert 8.0.6软件对表3中以膜通量(Y)为响应指标的数据进行处理分析,结果见表4。

表3 Plackett-Burman试验设计及结果

表4 Plackett-Burman试验结果方差分析

2.3.2Box-Behnken试验。在Plackett-Burman试验的基础上,固定料液流量为3.0 mL/min,超滤温度为40 ℃。以青钱柳多糖膜过滤浓缩工艺的膜通量(Y)为响应值,以料液质量浓度(A)、超滤压力(B)和超滤时间(C)共3个因素进行Box-Behnken试验。青钱柳多糖膜过滤浓缩工艺优化试验设计及结果见表5,模型的方差分析及结果见表6。

表5 Box-Behnken试验设计及结果

表6 回归模型方差分析

运用Design-Expert 8.0.6软件对表5的数据进行多元回归拟合,获得膜通量(Y)对应青钱柳多糖膜过滤浓缩工艺条件中料液质量浓度(A)、超滤压力(B)和超滤时间(C)的回归模型二次多项方程为Y=-111.129 0+54.269 0A+1.073 4B+0.756 4C-0.085 3AB+0.043 0AC+0.006 9BC-11.761 0A2-0.004 4B2-0.034 6C2。

各因素交互作用对青钱柳多糖膜过滤浓缩工艺膜通量影响的响应面见图7。响应曲面的坡度越陡峭对以膜通量为响应值的影响越大[29];响应曲面的投影形成的等高线,其越接近椭圆形,料液质量浓度(A)、超滤压力(B)和超滤时间(C)的交互作用程度则越显著[30]。由图7可知,AB和BC的响应曲面坡度相对较陡峭,等高线图形更接近椭圆形,说明AB和BC的交互作用对青钱柳多糖膜过滤浓缩工艺膜通量的影响显著(P<0.05),且存在最大值;AC交互作用对青钱柳多糖膜过滤浓缩工艺膜通量的影响不显著(P>0.05),这与方差分析结果一致。

图7 各因素交互作用对膜通量影响的响应面Fig.7 Response surface of effects of interaction between each factor on membrane flux

2.4 验证试验对回归模型方程进行分析与求解,获得青钱柳多糖膜过滤浓缩的最佳工艺条件为料液质量浓度1.91 g/mL、超滤压力123.3 kPa、超滤时间24.53 min;在此最佳条件下,膜通量的理论值为16.02 mL/(m2·min)。考虑试验的实际操作性,将最佳工艺条件修正为料液质量浓度1.90 g/mL、超滤压力123.0 kPa、超滤时间24.00 min。在修正后优化条件下,膜通量的实际值为16.01 mL/(m2·min),与预测值的相对误差为0.06%,说明该模型拟合度较好,具有一定的实际应用性。

3 结论

该研究以膜通量为响应指标,采用单因素试验和Plackett-Burman试验确定了对响应值影响显著的因素,并结合响应面试验优化了青钱柳多糖超滤膜过滤的工艺条件。最终获得最佳工艺条件为料液质量浓度1.90 g/mL、料液流量3.0 mL/min、超滤压力123.0 kPa、超滤温度40 ℃、超滤时间24.00 min,此时,膜通量为16.01 mL/(m2·min)。该研究为青钱柳多糖系列产品的开发与生产提供了工艺参考和理论依据,具有一定的实际应用意义。