余江勤,赵振新

(1.务川仡佬族苗族自治县农业农村局,贵州遵义564300;2.贵州省水产研究所,贵州贵阳 550025;3.贵州省特种水产工程技术中心,贵州贵阳 550025)

茶多酚(Tea polyphenols)又被称作茶鞣质、茶单宁,是茶叶中多种酚类物质的总称,约占茶叶干重的40%[1]。具有抗氧化剂、降低血糖血脂和极强的杀菌和抗病毒作用,在人类医学、食品加工、畜牧和水产养殖研究中受到广泛关注。茶多酚主要包含酚酸类(Phenoliaeids)、黄烷醇类(Flavanols)、黄烷酮类(Flavanones)和花色苷及其苷元(Glyeosids and their aglyeons of plant pigments)4种类型的化合物,由于这些物质都是2-苯基苯并吡喃结构,故也被统称为类黄酮物质[2-4]。通常,茶多酚是一种棕色或淡黄色粉末,具有涩味,微吸湿,微溶于油,易溶于水。茶多酚在pH 2～7的环境内非常稳定,但当处于pH>8的环境或阳光照射下,会发生氧化褐变,同时会与铁离子生成绿色的化合物。

大量药理研究表明茶多酚是一种良好的天然抗氧化剂,其能够消除体内过剩的自由基,抗菌消炎提高机体免疫力,同时还可以发挥减脂及降低血糖等作用功效[5-8],在畜禽生产和临床医学研究中受到广泛关注。而在水产动物中同样也表现出良好的免疫调节功效,因此在水产养殖中上有了广泛的应用和研究前景。重点综述了茶多酚的主要成分活性、理化特性和作用机制,以及在水产养殖中的研究进展,并展望了茶多酚在水产养殖中的应用前景,以期为茶多酚广泛应用于水产养殖研究中提供理论支撑。

1 茶多酚主要成分活性及理化特性

在茶多酚所有活性成分中,黄烷醇含量最高(70%～80%),主要为儿茶素(Catechins)[9]。其中儿茶素主要包含4类茶叶中最丰富的水溶性化合物质(图1),分别是没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)和表儿茶素(EC)[10-12]。而EGCG约占茶多酚制品的50%,是茶叶中含量最高的酚类成分[13]。

图1 茶多酚主要成分化学结构Fig.1 Chemical structure of the main components of tea polyphenols

1.1 茶多酚主要成分活性特征

1.1.1没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。EGCG是儿茶素中含量最高的成分,由于其化学结构中存在多个酚羟基,这使其成为茶多酚中发挥生物活性最多的化合物质[14]。而EGCG在体内主要分布于肠道和肝脏中,并通过葡萄糖醛酸化、磺酸化、生甲基化和水解反应生成相应的代谢产物(图2),从而发挥着抗肿瘤、抗氧化和抗炎症等多重功能[15-19]。

图2 EGCG在体内的代谢机制Fig.2 Metabolic mechanism of EGCG in vivo

许多实验室研究及流行病学调查均表明,EGCG可通过影响细胞内不同代谢通路,诱导肿瘤细胞凋亡,从而对多种肿瘤细胞如结肠癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等均具有抑制作用。Sen等[20]研究发现,表皮生长因子(EGF)能诱导上调乳腺癌细胞中基质金属蛋白酶(MMP-9)基因的表达从而促进癌细胞的转移,而EGCG处理后则会发现细胞中FAK/ERK的磷酸化受到抑制,下调了MMP-9的表达水平,从而抑制了癌细胞的转移。Wei等[21]在体外试验中发现,EGCG可以抑制葡萄糖酵解代谢途径中的关键调节因子和酶的活性和表达,从而抑制乳腺癌细胞生长。此外,研究者还发现EGCG 可以通过抑制MDA-MB-231细胞中PCNA、CDK 4,CDK 1、Cyclin D和Cyclin E的表达,使癌细胞停止分裂[22]。

EGCG结构中的酚羟基可为氧化还原反应提供氢,并通过调节体内蛋白激酶相关基因和抗氧化酶活性的表达,从而减少细胞内氧自由基的水平含量来增强化合物的稳定性,被视为一种强大的氧化还原剂[23]。此外,EGCG还可以改善由物理或化学刺激,如电磁辐射、钒中毒或砷中毒引起的蛋白质羰基含量(PCC)和脂质过氧化(LPO)的上升以及超氧化歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶基因表达的下调[19,24-25]。类似的研究还发现,EGCG可通过Nrf2-Keap1途径恢复博来霉素对Wistar大鼠诱导的氧化应激损伤[26]。

EGCG除了具有抗肿瘤和抗氧化作用外,还能通过调节炎症相关代谢通路,从而抑制相关炎症因子的表达。相关研究发现,EGCG可通过激活Tollip信号通路,减少脂多糖诱导的炎症反应[27]。同时还能通过抑制环氧化酶 2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(i NOS)的活性,以及ERK通路、MAPK/p38通路、Akt和NF-κB/p65通路信号分子的磷酸化,减少由脂多糖诱导的炎症因子的表达[28-29]。

1.1.2表儿茶素没食子酸酯(ECG)。ECG的分子式为C22H18O10,和EGCG同为酯型儿茶素,二者结构仅在B环上有一个酚性羟基的差异(图3)。ECG约占茶鲜叶干重的3%～6%,是茶多酚中含量仅次于EGCG的儿茶素。相关生物学活性研究发现,ECG和EGCG间存在一定的差异。Li等[30]研究发现,ECG的心肌保护和强心作用功能比EGCG更强。Pan等[31]明确指出,ECG和EGCG可从多个代谢通路抑制癌细胞的生长和转移,但其作用的效应靶点有所不同。如与EGCG相比,ECG可以更好地通过抑制ERb、PDGF-Rb、FAS和β-连环蛋白的活性限制细胞生长。此外,在不同的试验系统中,EGCG抑制AP-1的活性和细胞生长显著高于ECG。而ECG可以通过增加TNFα的释放和ROS的生成,从而抑制KATO III和DU14细胞的凋亡。而Deng等[32]发现,ECG可显著改善C2C12小鼠骨骼肌细胞中游离脂肪酸所引诱的胰岛素抵抗能力,且效果优于EGCG。同时,相关研究还表明,ECG可通过下调MMP-2和MMP-9表达水平及其相互作用,从而抑制MT1-MMP的激活,与EGCG具有较强的抗侵袭能力[33]。

图3 表儿茶素没食子酸酯在植物体内的合成途径Fig.3 Synthesis pathway of ECG in plants

1.1.3表儿茶素(EC)。EC化学式为C15H14O6,相对分子量为290.27,呈多环大分子结构,由A、B、C 3个环组成,含有多个羟基,具有独特的抗氧化性能[34]。EC主要通过两种机制发挥抗氧化功能,一是通过上调抗氧化酶活性表达水平减少氧自由基的生成,二是与金属离子发生化合反应[35]。Megow等[36]研究表明,EC可以通过促进皮肤细胞内抗氧化酶SOD、CAT活性,清除过多的氧自由基,防止皮肤细胞氧化损伤。Maheshwari等[37]研究发现,EC处理后的人类红细胞可以缓解五氯苯酚引起的氧化损伤。Boonsorn等[38]研究表明,在常温稀释液中添加适宜浓度的EC保存24 h后,可有效维持猪精子的活力。Greifov等[39]研究证明,100 μmol/L 的EC可显著增强牛精子线粒体活性。而核磁共振波谱检测发现表EC对精子和粒体的膜结构具有很高的亲和力,为EC对线粒体代谢调控机制提供理论依据[40]。

1.2 茶多酚理化特性

1.2.1抗氧化作用。自由基是独立存在的单个或多个不配对电子的基团或原子,分别是氧自由基、活性氧自由基和活性氮自由基,均具有极强的氧化活性,过量会导致某些细胞正常功能的破坏。而茶多酚为稠环芳香烃结构,其主要以含有许多高活性酚羟基的α-苯基苯并二氢吡喃为主体,当茶多酚中苯环上的电子与氧原子中不成对的单电子相互作用时,会产生共辄效应,使得不成对的单电子接近苯环,氢氧键减弱。因此,茶多酚作为一种良好的中子或氢给予体,能够与机体发生氧化应激过程中产生的98%以上自由基反应生成较为稳定的酚氧自由基,从而缓解机体氧化应激损伤[41-43]。研究表明,茶多酚抗氧化效果显著高于传统抗氧化剂维生素E和维生素C[44]。如通过模拟大白鼠体内脂质过氧化应激试验,发现茶多酚对脂质过氧化抑制效果明显,且高于维生素C 18倍、高于维生素E 16倍[45]。

此外,茶多酚还能通过调控细胞内生成自由基的催化酶系统,如细胞色素酶系统、髓环氧化酶系统和过氧化物酶系统等而减少自由基的产生(图4)。如茶多酚防止肿瘤细胞病理条件下自由基的聚集,其机理是通过抑制细胞中细胞色素活化系统及细胞色素还原酶的活性[46]。而通过增加绿茶内源性抗氧化剂浓度,可显著抑制自由基链式反应的发生,提高细胞的抗氧化能力[47]。同时,茶多酚的3′,4′-邻二羟基结构可与细胞中游离的金属离子发生螯合反应,从而减少活性氧离子的产生。田芝娟等[48]研究表明,茶多酚对重金属离子具有吸附作用,可与铜离子、钙离子、亚铁离子、铁离子等形成络合物,从而减轻重金属对细胞的毒害作用。

图4 茶多酚在蛋白质(酶)中的氧化还原调节机制Fig.4 Redox regulation mechanism of tea polyphenols in proteins (enzymes)

1.2.2降脂、降血糖作用。茶多酚可通过抑制脂类物质的吸收与合成或调节肠道微生物菌群结构等方式达到降脂的作用[49]。Lu等[50]研究发现,茶多酚可抑制大鼠肝脏中调节肥胖相关代谢通路基因的表达从而降低大鼠的体重。Wang等[51]通过体内注射茶多酚发现小鼠血甘油三酯、胆固醇、葡萄糖和清胰岛素含量显著降低,肠道微生物菌群结构多样性增加。而在高脂饲料中添加0.02%的茶多酚饲喂小鼠,可有效增加肠道中乳酸菌的数量,显著降低体脂和减缓肝脏脂肪肥大变性[52]。

此外,茶多酚还可以增强糖代谢相关酶活性,抑制葡萄糖吸收,促进糖原合成,从而达到降低血糖的作用。茶多酚中的活性成分EGCG可通过下调小鼠的原代肝细胞中FoxO1转录因子和PKA信号通路,并增加AMP依赖的蛋白激酶活性,抑制糖异生和糖原分解,调节体内葡萄糖稳态[53]。研究表明,茶多酚可通过抑制对Na+依赖的葡萄糖转运体的转运作用,减少肠道内葡萄糖的吸收,防止餐后血糖的增加[54]。同时,茶多酚可使患有糖尿病小鼠肝脏中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶mRNA的表达降低,葡萄糖激酶基因的表达水平上调,显著增加患病小鼠的糖耐量[55]。

1.2.3杀菌、抗病毒作用。茶多酚具有良好的杀菌作用,其原因主要体现在3个方面:一是茶多酚分子中含有大量的疏水性的苯环和酚羟基,可与蛋白质分子中的—COOH或—NH2发生疏水结合和氢结合,从而影响了细菌对蛋白质的利用,有效抑制细菌生长繁殖;二是茶多酚能够与细胞酶相互作用,通过降低细胞酶活性抑制细菌生长;三是茶多酚可通过与细胞膜上特异性蛋白相结合,抑制外界物质进入细胞内,从而影响细菌对营养物质的摄入和利用。研究人员在结晶紫试验中发现茶多酚可作用于大肠埃希氏菌的细胞膜,改变其通透性,使其失去活性[56]。Guo等[57]通过体内外试验,发现茶多酚浓度增加,能够显著减少副猪嗜血杆菌生物被膜的形成,抑制其生长发育。此外,茶多酚还能作为益生元促进肠道内有益菌的生长发育,平衡肠道中微生物群落的生态环境。研究表明,茶多酚能调节人体肠道菌群紊乱,并且经过肠道菌群产生的代谢产物有益于肠道健康[58]。

茶多酚对DNA和RNA病毒均有明显的抑制作用。DNA病毒广泛存在于昆虫、脊椎动物以及人体内,如疱疹病毒、腺病毒、乙型肝炎病毒等。Isaacs等[59]测试了多种黄酮类物质的抗疱疹病毒效果,结果表明茶多酚的效果最为显著,并且还发现EGCG可通过直接破坏病毒粒子而使病毒失活。而另一研究也证明茶多酚可抑制乙型肝炎病毒2种抗原的表达,并能阻止其基因组DNA的产生[60]。而西尼罗河病毒、丙型肝炎病毒、登革病毒、寨卡病毒等都属于RNA病毒。Chowdhury等[61]进行抗丙型肝炎病毒药物筛选研究,结果显示茶多酚可以直接作用于病毒粒子,并阻断细胞间的传播,从而抑制病毒的毒性发作。Vzquez-Calvo等[62]证实EGCG可显著抑制西尼罗河病毒的增殖,主要是通过影响病毒复制过程中的吸附与入侵过程,并且对病毒颗粒发挥直接的杀毒作用。

2 茶多酚在水产养殖中的应用研究

由于茶多酚具有良好的抗氧化、杀菌抗病毒、消炎降脂等功效,其在水产动物养殖及加工研究中的应用也日益增多,并表现出较好的免疫促进、促生长、改善肉质及保鲜作用。

2.1 茶多酚对水产动物抗氧化功能的影响研究表明,动物机体受到外界不良因子刺激后发生的氧化应激反应程度是评价健康状态的重要指标之一[63]。而茶多酚及其活性物质具有良好的抗氧化作用,可通过调节抗氧化相关代谢通路,清除氧自由基,缓解氧化应激损伤,从而改善动物机体的健康状况。徐奇友等[64]在虹鳟营养研究中发现,添加茶多酚(50～100 mg/kg)可显著上调肝脏和肌肉中抗氧化酶基因表达水平,增加SOD等酶活性,并降低肌肉和血浆中丙二醛(MDA)的含量。Ji等[65]对大黄鱼脂肪合成代谢通路研究发现,添加200 mg/kg的茶多酚可通过下调通路中相关基因的表达水平,从而改变肌肉粗脂肪和肝脏脂肪含量,并且可增强SOD和降低MDA含量,提高机体抗氧化能力。茶多酚还可提高团头鲂肝脏中过氧化氢酶(CAT)、SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和基因表达水平,缓解亚硝酸盐与氨氮诱导的氧化应激损伤[66-67]。在高脂饲料中添加200 mg/kg 的茶多酚可使大菱鲬平肝脏中脂肪酸降解相关基因表达上调,合成相关基因表达下调,降低肝脏脂肪含量,提高抗氧化酶相关基因的表达量和酶活性[68]。

2.2 茶多酚对水产动物生长性能的影响茶多酚在不同水产动物中都体现出了良好的促生长作用(表1)。Abdel-Tawwab等[72]在罗非鱼营养研究中发现,500 mg/kg的茶多酚添加水平对鱼体生长性能有显著促进作用。Long等[66]在对团头鲂营养研究中发现,饲料中添加茶多酚水平为50 mg/kg时,与对照组相比生长性能显著提高。然而,茶多酚过量添加会对鱼体生长性能产生抑制的作用。添加50 mg/kg茶多酚时可显著提高青鱼特定生长率,但随着添加水平的增加,其生长性能呈下降趋势,当添加水平达到500 mg/kg时,生长性能显著降低[70]。徐奇友等[64]在虹鳟上的研究结果显示,过量的茶多酚添加水平(500 mg/kg)对虹鳟的生长有抑制作用。而刘振兴等[69]研究表示,在饲料中茶多酚添加水平为166 mg/kg时,罗非鱼生长性能显著高于对照组,但当添加浓度达到333 mg/kg时,其生长受到明显的抑制。同时,最新研究也发现,90 mg/kg的茶多酚对杂交鲟生长性能有显著的促进作用,但当添加水平超过90 mg/kg时,其生长性能与添加水平呈负相关。

表1 茶多酚对鱼类增重及饵料系数的影响

2.3 茶多酚对水产动物肉质的影响鱼类肌肉的品质受到多种因素的影响,如风味成分(脂肪酸和游离氨基酸)、营养成分和感官品质(pH、系水力、硬度等)的综合表现[73]。而由于茶多酚具有强抗氧化等理化特性,关于其对鱼类肉质影响研究已有相关报道。在大黄鱼饲粮中添加茶多酚对n-3系列多不饱和脂肪酸没有显著影响[65],但在虹鳟营养研究中发现,适宜浓度的茶多酚添加到饲料中饲喂虹鳟可增加肌肉中二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的含量[74]。在罗非鱼的研究中,适宜剂量的茶多酚能够降低粗脂肪和增加鱼体粗蛋白的含量[69]。适宜剂量的茶多酚能够降低黑石斑鱼肌肉中粗脂肪的含量,但对粗蛋白没有显著影响[71]。以上差异表明,茶多酚对鱼体肉质的影响可能与使用剂量、鱼的食性及品种有关。此外,肌苷酸(5′-IMP)是调节肌肉风味品质的重要物质,且能与腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)协同作用缓解食物的酸和苦味[75]。姜佳星[76]研究发现,茶多酚可提高草鱼肌肉中ATP含量,而ATP含量的上升可以增加宰后肌肉中5′-IMP的含量[77]。因此,茶多酚可能会提高草鱼肌肉中5′-IMP含量,从而改善鱼肉风味。

2.4 茶多酚对鱼肉保鲜效果的影响鱼肉营养丰富,但由于其含有大量的不饱和脂肪酸,在保存过程中易发生氧化变质,对水产品的口感风味和食品卫生安全造成不利影响,是鱼肉生加工过程中急需解决的核心问题。而茶多酚作为一种良好的天然抗氧化剂,能够有效抑制细菌繁殖,以及挥发性三甲胺等物质的产生,防止脂质氧化,从而延长鱼肉产品保鲜期。Li等[78]采用茶多酚对鲫鱼肌肉进行保鲜处理,发现pH、硫代巴比妥酸和挥发性盐基氮显著低于对照组,有效延长了冷藏鲫鱼的货架期7～8 d。王朝瑾等[79]通过超临界萃取茶叶中茶多酚,发现1.60%的茶多酚处理过的南美白对虾保鲜时间显著增加至8 d。陆剑锋等[80]研究对比不同种抗氧化剂酚对斑点叉尾鮰内脏精炼鱼油的抗氧化效果,结果发现茶多酚的效果最明显,并发现柠檬酸等物质对茶多酚抗氧化效果有良好的协同增效作用,证明茶多酚与其他抗氧化剂复合使用可产生良好的保鲜效果。

3 问题与展望

由于茶多酚含有多种生物活性物质,具有良好的促生长、改善肉质、保鲜及免疫功能,在临床医学、畜禽养殖及食品加工等领域研究已见诸多报道。然而,茶多酚在渔业中的研究仍处于起步阶段,尚有诸多核心问题需要深入探讨。

(1)茶多酚应用于水产物种的多样性研究相对较少。水产养殖动物种类繁多,但与茶多酚研究相关的品种相对较少,尤其在无脊椎动物上仍未见相关报道,因此有必要加强在不同品种水产动物上茶多酚相关的应用研究。

(2)茶多酚对水产动物的生物学功能需进一步完善。目前虽已有关于茶多酚对水产动物生长性能、免疫调控等生物学功能指标的影响研究,但具体机制方面的研究仍鲜有报道。如茶多酚在鱼体中发挥抗氧化的作用机理、茶多酚对鱼体肠道微生物菌群的影响及调节、茶多酚与肝脏细胞铁死亡的互作机制等。

(3)茶多酚在水产养殖品种中的使用策略也应进一步探索。不同鱼类品种,其营养需求、代谢规律、生活环境、抗病力等不尽相同。因此根据不同鱼类品种特性开展相关研究,探讨其适宜的使用剂量、使用时机及使用方法。

(4)茶多酚与其他添加剂的复合使用效果有必进一步阐明。茶多酚能否和其他水产投入品复合使用,如中草药、益生菌及其他免疫增强剂等,以及使用后的效果、作用机制和安全性等问题需要深入探讨。

(5)茶多酚的提取工艺对生物活性的影响值得深究。由于茶多酚活性成分种类较多,各成分的提取工艺存在差异。因此茶多酚活性成分提取工艺技术需不断完善与改进。随着茶多酚在水产养殖中相关的研究不断深入,茶多酚在渔业生产中将会有广阔的应用前景。