夏九鲜,郑旺华,王 磊,亐开兴,尹革芬,毕峻龙*

(1.云南农业大学,云南昆明 650201;2.昆明市西山区动物防疫检疫服务中心,云南昆明 650100;3.云南省普文公路动物防疫监督检查站,云南景洪 666100;4.楚雄师范学院,云南楚雄 675000)

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)属于黄病毒科瘟病毒属,与猪瘟病毒(classical swine fever virus,CFSV)等病毒存在一定的同源性,且具有结构的相关性和抗原的相关性[1]。依据猪体免疫攻毒、琼脂扩散、中和试验以及免疫荧光试验结果可知,牛病毒性腹泻病毒与猪瘟病毒之间有较强的免疫学关系,2种病毒可溶性抗原相同的概率非常高[2]。由于BVDV感染猪后出现的临床症状与非典型性猪瘟的症状极为相似,加之临床上猪瘟病毒感染出现典型症状的概率较小,在检测猪瘟病毒的过程中时常将BVDV感染误判为猪瘟病毒感染[3-4]。猪被BVDV感染后,体内会形成与猪瘟病毒交叉的中和抗体,导致血清学诊断结果出现错误,从而会影响对BVDV的有效诊断和及时控制;同时,猪感染BVDV后成为一种潜在的传染源,能传染周边的牛和羊,从而造成严重的经济损失[5-6]。BVDV在多种动物之间相互传播还可能会引起该病毒的不断循环和漂移,从而威胁人类健康[7]。此外,猪体内BVDV抗体能够抑制猪瘟病毒,猪感染BVDV后会对猪瘟疫苗的免疫造成影响,导致猪瘟疫苗的效果变差,成为猪瘟防控工作中的不利因素。许多持续性感染处于免疫耐受状态,猪体内不一定产生抗体,处于长期带毒、排毒状态,从而造成BVDV的扩散和传播[3,7]。前期笔者所在科研团队已完成云南省一些地区牛感染BVDV的流行病学调查和毒株分离[8-9],但对猪感染BVDV的流行病学调查尚未开展。笔者利用RT-PCR检测方法对云南省部分地区猪群开展BVDV流行病学调查,以期为云南省猪瘟的防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1样品来源。自2020年云南省部分地区不同规模养殖场各生长阶段猪群采集211份粪便样品,其中108份来自散养户,103份来自规模猪场。各生长阶段猪群粪便样品详见表1。

表1 不同规模猪场各生长阶段猪粪便样品

1.1.2引物合成。用于扩增BVDV的特异性引物由云南农业大学传染病实验室设计并提供,由昆明硕擎生物科技有限公司合成,TYF1为5′-GAGTACRGGGTAGTCGTCA-3′,TYR1为5′-TCCATGTGCCATGTACAGCAGA-3′,产物预期扩增片段大小220 bp。

1.2 方法

1.2.1样品处理。将采集粪样浸入0.9%生理盐水中,用力摇晃使粪便与生理盐水混合,于4 ℃下过夜后将液体转移到新的无RNAase离心管中;4 ℃ 3 000 r/min下离心10 min,将上清液吸到新的无RNAase离心管中;去除粪便残渣,用于核酸提取。

1.2.2RNA提取。于2 mL离心管中加入300 μL处理好的粪便样品,加入800 μL RNAiso Plus(TRIzol),上下反复颠倒,使RNAiso Plus(TRIzol)与样品混匀,4 ℃下静置10 min;10 min后再加入160 μL氯仿溶液,上下反复颠倒15 s使两相彻底混匀,4 ℃静置10 min,12 000 r/min离心15 min;小心吸取上层无色溶液约500 μL置于新的1.5 mL无RNAase离心管中,加入等量异丙醇,4 ℃静置10 min,12 000 r/min离心10 min,使RNA沉淀于离心管底部;小心倒去上清液,向离心管内加入1 mL 75%乙醇清洗,7 500 r/min离心5 min;倒去上清液,轻甩后用吸水纸吸干离心管壁的液体,每管加入20 μL DEPC水溶解RNA,瞬时离心,取5 μL RNA加样到1.5%琼脂糖凝胶(含0.2% EB)孔中,150 V电泳15 min,在凝胶成像系统上观察提取RNA的完整性,并使用核酸定量仪定量RNA浓度。

1.2.3RNA反转录。反转录体系2×ES Reaction Mix(含10×RT Buffer,dNTPs) 5.0 μL;EasyScriptTM RT/RI Emzyme Mix(含RNase Inhibitor,反转录酶)0.5 μL;下游引物1.0 μL;模板RNA 3.5 μL;总反应体系10.0 μL。反转录程序:42 ℃ 30 min;85 ℃ 5 min。

1.2.4BVDV检测。以反转录cDNA为模板,进行PCR扩增。PCR反应体系(25.0 μL)如下:2×TransHiFi Ⅱ 12.5 μL、ddH2O 10.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、cDNA 1.0 μL。PCR扩增程序如下:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,循环35次;72 ℃ 5 min;于4 ℃下暂存。取10 μL PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶(含0.2% EB)电泳15 min后,置于凝胶成像系统下观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 BVDV检测通过BVDV特异性引物进行PCR扩增,对211份粪便样品进行检测和鉴定,所获PCR产物电泳结果与预期目的片段大小(220 bp)相符,确定部分粪便样品BVDV检测呈阳性(图1),其中24份样品BVDV检测呈阳性,阳性率为11.37%(24/211)。

注:1.阴性对照;2～6.部分样品BVDV电泳鉴定结果;M.DNA Marker 1 000。Note:1.Negative control;2-6.BVDV electrophoresis identification of partial samples;M.DNA Marker 1 000.图1 BVDV核酸检测电泳结果Fig.1 The electrophoresis results of BVDV detection

2.2 不同规模猪场BVDV感染情况由表2可知,从散养户采集108份粪便样品,从规模猪场采集103份粪便样品。通过对PCR产物进行鉴定与统计发现,散养户猪粪便感染BVDV的阳性率为16.67%(18/108);规模猪场猪粪便感染BVDV的阳性率为5.83%(6/103),表明BVDV感染在猪场普遍存在。

表2 不同规模猪场的BVDV感染情况

2.3 不同生长阶段猪BVDV感染情况由表3可知,66份哺乳仔猪粪便样品中检出阳性样品5份,阳性率为7.58%(5/66);72份断奶仔猪粪便样品中检出阳性样品15份,阳性率为20.83%(15/72);34份育肥猪粪便样品中检出阳性样品4份,阳性率为11.76%(4/34);39份种母猪粪便样品中未检出阳性样品,阳性率为0(0/39)。由此可见,不同生长阶段猪感染BVDV的情况不一样,种母猪样品未检出BVDV阳性,这可能是由于样品数量偏少所致。

表3 不同生长阶段猪群的BVDV感染情况

3 讨论

BVDV感染在牛群中极为普遍[10],并能通过粪便排泄向外排毒,成为持续的传染源,从而感染多种家畜[11-14]。王新平等[12-13]通过双夹心ELISA方法检测出BVDV在牛、羊、鹿群中的感染率分别为16.5%～89.0%、14.6%～83.3%和19.6%～44.4%,后来从内蒙古哲盟疑似猪瘟病料中首次检出BVDV。

从不同养殖规模来看,散养户送检样品中BVDV阳性检出率高于规模化养殖场,很可能是由于散养户生物安全意识淡薄,养殖过程中存在多种动物混养;同时,该病感染后很少出现明显的临床症状,带毒猪作为传染源难以被发现并淘汰,导致该病的持续传播[14]。该研究首次对云南省猪感染BVDV进行流行病学调查,发现散养户与规模猪场的BVDV阳性率分别为16.67%和5.83%,与孙泉云等[11]对我国猪源BVDV的研究报道相一致,在猪舍条件简陋、生物安全性低、防疫理念差的散养户猪群中BVDV感染情况最严重,因而我国广大农村养猪业者应该引起足够重视,并减少多种牲畜的混喂混养。

从不同生长阶段的猪粪便样品检测结果来看,不同生长阶段的猪感染BVDV的程度不一样。聂兆晶[15]对山东省BVDV流行情况的调查发现母猪和仔猪血清中BVDV抗体阳性率分别为45.3%和32.5%,猪场阳性率达88.5%(23/26);母猪和断奶仔猪中BVDV的阳性率远高于其他日龄的猪。该研究中哺乳仔猪、断奶仔猪、育肥猪及种母猪BVDV的阳性率分别为7.58%、20.83%、11.76%和0,其中断奶仔猪阳性率较高,而检测的种母猪未感染BVDV。戴爱玲等[16]对福建龙岩规模化猪场猪感染BVDV流行情况进行调查时发现BVDV感染率为28.6%,猪场BVDV阳性率高达94.4%,种猪猪瘟免疫应注意防范BVDV污染。此外,猪被BVDV感染后,体内会形成与猪瘟病毒交叉的中和抗体,导致血清学诊断结果出现错误,最终会影响对BVDV的有效诊断与及时控制[5];同时,猪感染BVDV后生产力大大降低,并成为一种潜在的传染源,能传染附近的牛群和羊群,从而造成严重的经济损失[6]。因此,在检验检测中应考虑BVDV与CSFV混合感染情况,减少误诊误判。

在肉牛、牦牛养殖中,BVDV感染普遍存在。高双娣等[17]研究发现西北和西南五省(区)黄牛的BVDV阳性率为46.15%,牦牛的BVDV阳性率为30.08%;孟庆森等[18]从不同省份采集451份样品,血清的BVDV中和抗体阳性率为25.6%～91.1%,总阳性率为78.5%;研究表明,青海、西藏牦牛群BVDV的阳性率在27%以上[19-20]。笔者前期研究表明云南省4州(市)10县(市)BVDV的抗体阳性率为0～60%,整体抗体阳性率为16.45%,各地区之间阳性率差异较大[9],但对云南省猪感染BVDV的流行病学调查尚属首次,今后应当结合多种家畜腹泻发生率来综合考虑BVDV防控。近年来,我国在猪瘟防控上收效甚微,很可能是由于BVDV流行所致。猪群因免疫被BVDV污染的猪瘟疫苗而感染,感染BVDV后又会影响猪瘟疫苗的免疫效果,因此在猪瘟防控过程中猪瘟疫苗BVDV的污染状况和猪群感染BVDV情况不容忽视,今后应当加强BVDV和CSFV的相关基础研究。在流行病学调查中充分结合多种家畜混养区的BVDV流行和混合感染情况,做出流调的全面分析与防控[7,18,21-22],为今后云南省猪群BVDV和猪瘟的防控奠定理论依据。