李婷婷,刘希元,滕 巍,马 燕,梁 爽,李彦军*

(1.吉林省蔬菜花卉科学研究院,吉林长春 130033;2.吉林农业大学园艺学院,吉林长春 130118)

开放式组织培养是指舍弃超净工作台与高温高压灭菌锅等设备的使用,改变传统消毒灭菌方式,在自然、开放的环境中进行的植物组织培养[1]。目前已有蓝莓[2]、香蕉[3]、魔芋[4]、梅花[5]、红豆杉[6]等植物开展了开放式组织培养的研究,开放式组织培养应用的抑菌剂有抗生素[7-9]、消毒剂[10]、食品添加剂[11-12]、植物提取物[13]等。除添加抑菌剂外,陈泽斌等[2]使用消毒剂对培养瓶浸泡消毒来降低污染率,但并未明确介绍浸泡消毒浓度。

开放式组织培养脱离严格的无菌环境,降低了植物组织培养对设备的要求,简化了技术操作,节约了能源成本[14],促进了组织培养技术的应用与推广。

在马铃薯开放式组织培养中,使用次氯酸钠溶液浸泡消毒容器、在培养基中添加抑菌剂的方法代替高温高压蒸汽灭菌,不使用高压灭菌锅与超净工作台,改变了传统组织培养的消毒方式,但次氯酸钠浸泡组培容器消毒浓度没有一定的标准参考;培养基中蔗糖的主要作用是为脱毒苗提供碳源,但培养基中蔗糖浓度影响组织培养的污染率[15];培养基中琼脂的主要作用是支撑固定脱毒苗[16],但琼脂浓度过低固定效果差,过高则会增加接种操作难度,琼脂浓度也影响培养基小环境进而影响到脱毒苗污染率,不经过高温高压湿热灭菌能够减少培养基中成分的损失[17],消毒灭菌方式改变后,综合考虑各因素之间的相互作用,需要对次氯酸钠浸泡组培容器消毒浓度、培养基中蔗糖浓度、琼脂浓度、益培隆浓度进行进一步优化试验。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂长势基本一致的夏波蒂马铃薯脱毒苗,由吉林农业大学园艺学院提供。MS培养基、蔗糖、琼脂、次氯酸钠、抑菌剂益培隆(A 10 mL/瓶,B 356 mg/瓶)、盐酸、氢氧化钠。

1.2 仪器与设备分析天平、游标卡尺、接种用剪子、接种用枪镊、酒精灯、不锈钢器具桶、便携式叶绿素仪、高压蒸汽灭菌锅。

1.3 方法

1.3.1培养基配制。使用次氯酸钠浸泡培养瓶与瓶盖30 min进行消毒,沥干水分备用,提前紫外照射实验室30 min,关闭紫外灯后使用75%乙醇喷雾消毒灭菌,MS培养基添加蔗糖、琼脂、抑菌剂益培隆,煮沸1 min后分装于提前准备好的培养瓶中,分装后紫外照射15 min不必进行高温高压灭菌。抑菌剂益培隆的配制方法:将益培隆B粉末均匀溶解于A溶液中,纯净水定容至100 mL。

1.3.2接种。紫外照射接种室30 min后使用75%乙醇喷雾消毒灭菌,接种前使用75%乙醇棉擦拭接种台消毒,接种过程中剪子镊子使用酒精灯灼烧消毒,备用的剪子镊子浸泡于75%乙醇不锈钢壶中,不使用超净工作台。剪取带有一个腋芽的脱毒苗茎段接种于培养基上。

1.3.3测量指标与方法。培养28 d后观察白化数、污染数、有效生长数,根据传统马铃薯脱毒苗生长指标设计脱毒苗有效生长植株标准,达到有效生长植株标准及以上且未发生污染的脱毒苗记为有效生长数。测量植株的株高、茎粗、干重、鲜重、叶片叶绿素含量,计数叶片数、茎节数,称重法计算叶面积,统计白化率、污染率、有效生长率。

白化率=白化数/总接种数

污染率=污染瓶数/总接种瓶数

有效生长率=有效生长数/总接种数

单因素试验使用DPS处理分析,响应面优化试验采用 Design-Expert进行设计与结果分析。

有效生长植株标准:株高8.70 cm,茎粗0.85 mm,叶片数7.00个,茎节数6.00个,鲜重156.00 mg,叶面积7.00 cm2。

1.3.4单因素及响应面优化试验设计。选择次氯酸钠浸泡组培容器消毒浓度、培养基中抑菌剂益培隆添加浓度、蔗糖浓度、琼脂浓度设计单因素试验,每个因素设计5个水平,3次重复。固定MS+0.6 mL/L益培隆+10 g/L蔗糖+ 6 g/L琼脂,pH 5.8,次氯酸钠浸泡消毒浓度设计为0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%;固定次氯酸钠浸泡消毒浓度1%、MS+10 g/L蔗糖+ 6 g/L琼脂,pH 5.8,抑菌剂益培隆浓度设计为0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL/L;固定次氯酸钠浸泡消毒浓度1%、MS+0.6 mL/L益培隆+ 6 g/L琼脂,pH 5.8,蔗糖浓度设计为0、2.5、5、7.5、10.0 g/L;固定次氯酸钠浸泡消毒浓度1%、MS+0.6 mL/L益培隆+10 g/L蔗糖,pH 5.8,琼脂浓度设计为2、4、6、8、10 g/L。每个处理接种20瓶,每瓶5个茎段,培养28 d后统计各处理有效生长率。

在单因素试验结果的基础上使用Design-Expert,以有效生长率作为响应指标,以益培隆浓度(A)、次氯酸钠浸泡消毒浓度(B)、蔗糖浓度(C)、琼脂浓度(D)为自变量,设计4因素5水平优化试验,响应面优化设计自变量因素见表1。

表1 响应面优化试验因素水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1不同次氯酸钠消毒浓度对脱毒苗污染率与白化率的影响。由图1可知,次氯酸钠浸泡消毒浓度在0～2.0%时,脱毒苗的污染率随着消毒浓度提高而逐渐下降,在消毒浓度提高至1.5%时,脱毒苗污染率降至10%,在消毒浓度提高至2.0%时,脱毒苗污染率下降为0。

图1 不同次氯酸钠浓度对污染率的影响Fig.1 Influence of different hypochlorous acid concentrations on contamination rate

但在次氯酸钠浸泡消毒浓度为1.5%与2.0%时,脱毒苗在接种后3 d内均出现叶片白化现象,白化率分别为13.3%与86.7%,但在叶片白化5～10 d生长点开始萌发并正常生长。次氯酸钠以氧化作用与氯化作用达到消毒抑菌的目的,可能因此出现残留导致叶片白化,生长点的正常萌发证明2%及以下的次氯酸钠浓度不致于杀死植株。

2.1.2不同益培隆浓度对组培苗污染率的影响。由图2可知,抑菌剂益培隆浓度0～0.8 mL/L时,脱毒苗的污染率随着培养基中添加浓度的提高而降低,在不添加抑菌剂益培隆时污染率最高达60.00%,益培隆浓度为0.4与0.6 mL/L时,污染率降低至10.00%与3.01%,在益培隆处理浓度为0.8 mL/L时脱毒苗污染率最低,达到无污染。

图2 不同益培隆浓度对污染率的影响Fig.2 Influence of different ipelon concentrations on the pollution rate

2.1.3不同蔗糖浓度对组培苗污染率的影响。由图3可知,在蔗糖浓度为0～10.0 g/L时,脱毒苗的污染率随着培养基蔗糖浓度的增加而上升,在培养基蔗糖浓度为10.0 g/L时,污染率最高可达20%。

图3 不同蔗糖浓度对污染率的影响Fig.3 Effects of different sucrose concentrations on the contamination rate

2.1.4不同琼脂浓度对组培苗污染率的影响。由图4可知,在琼脂浓度为2～4 g/L时,脱毒苗的污染率随着琼脂浓度提高逐渐升高,培养基中琼脂浓度为4 g/L时污染率最高达20%,可能原因为此时培养基呈现“半固态”,增加了污染率。培养基中琼脂浓度为2、8与10 g/L时污染率均为0。但在接种过程中发现,10 g/L琼脂浓度下培养基硬度大,增加了操作难度与成本。

图4 不同琼脂浓度对污染率的影响Fig.4 Effects of different agar concentrations on the contamination rate

2.2 开放式组织培养优化分析以益培隆浓度(A)、次氯酸钠浸泡消毒浓度(B)、蔗糖浓度(C)、琼脂浓度(D)为自变量,以有效生长率作为响应指标,使用Design-Expert设计4因素5水平Box-Behnken响应面试验,得到有效生长率(R1)的设计及结果(表2)。

表2 响应面优化试验设计及结果

对试验数据进行多元回归拟合得到有效生长率(R1)对益培隆浓度(A)、次氯酸钠浸泡消毒浓度(B)、蔗糖浓度(C)、琼脂浓度(D)的二次多项回归模型:R1=0.53+1.22A+0.48B+0.10C+0.12D-0.34AB-6.25×10-3AC+0.07AD-0.01BC+0.41CD-1.24A2-0.19B2-5.92×10-3C2-0.016D2。

响应面回归模型方差结果见表3,该模型回归方程(P=0.008 4<0.01)极显著,失拟项(P=0.142 5>0.05)不显著,表明二次多项模型拟合度较好,模型有意义,响应面试验可以真实充分反映结果。回归模型决定系数R2=0.934 1,表明试验精确度高,能够解释93%的变化。对比4个因素的F,得到各因素对有效生长率的影响从大到小为B(次氯酸钠)、C(蔗糖)、A(益培隆)、D(琼脂)。

表3 响应面设计各因素间交互作用与有效生长率方差分析

三维响应曲面图能够直观地反映各因素交互作用对有效生长率的影响。由图5可知,响应面曲面越陡,表示因素组合对有效生长率影响越显著。通过 Design-Expert 对数据模型进行拟合分析得到开放式组织培养最佳因素组合:次氯酸钠浸泡组培容器消毒浓度1.1%,培养基中益培隆浓度0.49 mL/L,蔗糖浓度7.5 g/L,琼脂浓度6.61 g/L,在此组合下脱毒苗有效生长率为82.57%,采用预测组合进行验证试验,有效生长率为82.50%,与理论值吻合良好,证明预测组合结果可靠,预测组合脱毒苗污染率为0,有一定的实际意义。综合考虑到实际操作等影响的因素,对优化组合结果进行修正,采用次氯酸钠浸泡容器消毒浓度1%、培养基中益培隆浓度0.5 mL/L、蔗糖浓度7.5 g/L、琼脂浓度6.6 g/L,进行验证试验,得到脱毒苗有效生长率为85%,接近预测值,进一步说明修正响应面优化组合结果的可靠性;且验证修正组合下脱毒苗无污染,有一定的实际意义。

图5 各因素交互作用响应曲面图Fig.5 Response surface diagram of the interaction of various factors

3 结论与讨论

在开放式组织培养中,培养基中添加抑菌剂的研究较多,而对组培容器进行浸泡消毒的研究较少。次氯酸钠在日常生活中多作为表面消毒剂使用。康俊等[18]使用200倍“84消毒液(次氯酸钠)”对组培容器使用浸泡消毒污染率减少42%,该研究中培养基中添加抑菌剂,使用1%次氯酸钠浸泡消毒效果更好。罗燕羽等[19]研究表明益培隆不适合在香蕉开放式组培中使用,该研究中益培隆可应用在马铃薯开放式组织培养中,说明开放式植物组织培养中抑菌剂的添加因植物种类不同而存在差异,在实际应用中要充分考虑抑菌剂对植物生长的影响。蔗糖在组织培养中为植物提供碳源,低糖浓度能够减少污染,但不同植物种类所需糖浓度不同[3,20],该研究中,开放式组织培养改变生长环境后,蔗糖浓度7.5 g/L条件下马铃薯植株生长状况良好。琼脂浓度决定了培养基形态[21-22],培养状态的不同对植株生长以及菌类生长均有一定影响,在开放式组织培养中对琼脂的研究较少,该研究采用6.6 g/L琼脂可以作为马铃薯开放式组织培养琼脂浓度参考。

该试验通过Design-Expert软件利用Box-Behnken分析法对马铃薯开放式组织培养条件进行优化设计,选取有效生长率为指标得到开放式组织培养最优组合:次氯酸钠浸泡容器消毒浓度1%,培养基中添加抑菌剂益培隆浓度0.5 mL/L、蔗糖浓度7.5 g/L、琼脂浓度6.6 g/L,各因素对有效生长率的影响为次氯酸钠>蔗糖>益培隆>琼脂。