周 俊 郭长青 王庆甫

1.北京中医药大学研究生院，北京 100029；2.北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029；3.北京中医药大学第三附属医院筋伤科，北京 100029

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种以膝关节疼痛、畸形、僵硬和功能障碍为主要症状的下肢骨退行性病变，是导致下肢残疾的十大常见疾病之一[1-5]。TLRs/NF-κB 通路介导的滑膜炎症是KOA 的主要病理变化[6-9]。然而KOA 滑膜炎症的发病机制目前尚不明确。外泌体是由细胞分泌的脂质双层膜小囊泡，可通过其富含的各类miRNA 对于Toll 样受体2（Toll-like receptor，TLR2）的抑制作用，调控TLRs/NF-κB 信号通路，参与炎症反应过程[10-13]。本研究拟通过动物实验，观察滑膜组织两种主要组成细胞的炎性外泌体对于家兔膝关节滑膜组织的影响，探讨在KOA 滑膜炎症过程中两种滑膜细胞来源外泌体对于TLRs/NF-κB通路的调控作用。

1 对象与方法

1.1 实验动物

健康成年家兔20 只，体重2.0～2.5 kg，购自北京金牧阳实验动物养殖有限公司，许可证号：SCXK（京）2015-0005。所有家兔均饲养于中国中医科学院医学动物实验中心。清洁级饲养，实验室平均室温（22±1）℃，空气湿度40%～50%。本实验通过中国中医科学院动物护理和使用委员会批准（20193003）。按照《实验动物护理和使用指南》福利伦理严格执行。

1.2 主要试剂

人成纤维样滑膜细胞系及巨噬样滑膜细胞系（上海ATCC 细胞库，批号：BFN680323）；DMEM 培养基、胎牛血清（invitrogen，批号：C111965500BT）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（Sigma 公司，批号：L2880）；外泌体提取收集试剂盒（北京恩泽康泰生物科技有限公司，批号：211-9053）；兔基质金属蛋白酶-13（matrix metallo proteinase，MMP-13）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin，IL-1β）、IL-6、酶联免疫吸附试验法试剂盒（abcam，批号：abc187235）；TLR-2、核转录因子NF-κB、髓样分化因子-88（myeloid differentiation factor-88，MyD88）、TNF 受体相关因子2（TNF receptor-associated factor 2，traf2）单克隆抗体（abcam，批号：abc434852）；二甲苯、石蜡（北京北化公司，批号：14052930）；苏木精-伊红染色试剂（Sigma 公司，批号：Y00030）。

1.3 实验方法

1.3.1 滑膜细胞炎性外泌体提取 将两种滑膜细胞复苏后常规培养。取3～4 代细胞，加入5 μl LPS/PBS 溶液（1 μg/ml）干预24 h 后收集两种细胞的上清液，利用试剂盒提取上清液中外泌体，将外泌体与生理盐水制备成混悬液（浓度为1×107/ml）并置于-80℃下保存备用。

1.3.2 家兔分组及干预 用随机数字表法将20 只家兔分为正常组、盐水组、A 组、B 组、A+B 组。正常组不予处理，A 组于右膝关节腔注射A 细胞外泌体混悬液、B 组注射B 细胞外泌体混悬液、A+B 组注射两种外泌体混合混悬液（两种混悬液按1∶1 混合），盐水组仅注射生理盐水。3 次/周，每次0.5 ml，连续注射2 周。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 行为学 干预后2 周，采用改良膝骨关节炎严重程度指数（Lequesne MG）对各组家兔局部疼痛、步态改变、关节活动范围和关节肿胀程度的刺激反应情况进行评估，记录总评分[14]。

1.4.2 各组家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 水平 将各组家兔用10%水合氯醛（2 ml/kg）耳缘静脉注射麻醉后，用采血针采集腹主动脉血15 ml，用半径10cm 的超速离心机4℃、3000r/min 离心10min后，取上清液，应用试剂盒检测各组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 水平。

1.4.3 蛋白质印迹法检测滑膜组织中TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白表达 取10 mg 滑膜组织，剪碎研磨后加入0.2 ml 的蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂混合液；4℃低温离心机，12 000 r/min 离心15 min 后，取清液置于新EP 管中，并进行标记分组。用BCA 试剂盒进行蛋白浓度测定，取适量蛋白进行电泳，电泳完成后进行电转，将目标蛋白转移至PVDF 膜上，将膜完全浸没在3% BSA-TBST 中室温轻摇30 min。用3%BSA-TBST 稀释一抗，参照TLR2、P65、MyD88、traf2及内参β-actin 等抗体说明书进行一抗标记，TBST 清洗4 次后，加入二抗室温孵育1 h，最后加入ECL 试剂后显影。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t 检验；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组家兔行为学Lequesne MG 指数

正常组及盐水组干预前后Lequesne MG 分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。A、B、A+B 组干预后Lequesne MG 指数均高于干预前，且A+B 且高于A组、B 组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组家兔行为学Lequesne MG 指数比较（）

表1 各组家兔行为学Lequesne MG 指数比较（）

注 与A+B 组比较，aP＜0.05。

2.2 各组家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 水平比较

正常组与盐水组家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；A、B、A+B 组家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6及MMP-13 水平高于正常组和盐水组（P＜0.05）；A+B组家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 水平高于A 组和B 组（P＜0.05）。见表2。

表2 各组家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 表达水平比较（ng/L，）

表2 各组家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 表达水平比较（ng/L，）

注 与正常组比较，aP＜0.05；与A 组比较，bP＜0.05；与B 组比较，cP＜0.05。TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-1β：白细胞介素-1β；IL-6：白细胞介素-6；MMP-13：基质金属蛋白酶-13。

2.3 各组家兔滑膜组织中TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白表达量比较

正常组与盐水组TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；A、B、A+B 组滑膜组织中TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白表达量均高于正常组（P＜0.05），其中A+B 组滑膜组织中TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白表达量高于A 组和B 组（P＜0.05），而A 组滑膜组织中TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白表达量高于B 组（P＜0.05）。见图1、表3。

图1 各组家兔膝关节滑膜组织中TLRs/NF-κB 通路相关蛋白条带图

表3 各组家兔滑膜组织中TLRZ、P65、MyD88、traf2 蛋白表达量比较（）

表3 各组家兔滑膜组织中TLRZ、P65、MyD88、traf2 蛋白表达量比较（）

注 与正常组比较，aP＜0.05；与A 组比较，bP＜0.05；与B 组比较，cP＜0.05。TLR2：Toll 样受体2；MyD88：髓样分化因子-88；traf2：TNF 受体相关因子2。

3 讨论

正常人体膝关节滑膜由内膜层和内膜下层组成，内膜层主要由A 型巨噬细胞样滑膜细胞（macrophage-like synoviocytes，MLC）、B 型成纤维细胞样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLC）构成。两者功能不同，A 细胞具有清除代谢产物，分泌炎症因子的作用；B 细胞主要功能是分泌透明质酸，调节关节液平衡[15-18]。NF-κB 是在炎症反应中处于核心地位的核转录因子，其在细胞中最常见的家族成员是P65 和P50。各种因素产生的体内损伤相关分子模式可以使Toll样受体（如TLR2、TLR4）激活，激活后的TLR2 可以与衔接蛋白（如MyD88、traf2 等）结合形成复合物，并通过一系列反应激活TLRs/NF-κB 信号通路，从而释放各种下游炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-6 和MMP-13等，引起滑膜固有免疫反应[19-21]。外泌体可以携带其来源细胞的蛋白质、脂质及核酸等信息物质，并与附近的受体细胞进行生物信号的传递，影响局部微环境，调节相关蛋白表达及调控相关生物学过程[22]。

在本研究中，A、B、A+B 组外泌体干预后的家兔行为学Lequensne MG 指数高于干预前（P＜0.05），并且在外泌体干预后家兔关节出现轻度肿胀，这说明关节内出现了炎症反应。酶联免疫吸附试验法及蛋白质印迹法检测结果提示两种滑膜细胞来源的炎性外泌体均可激活家兔滑膜TLRs/NF-κB 信号通路，引起滑膜炎症反应，并进一步损伤软骨，引起家兔的形态学改变。其中蛋白质印迹法显示A 细胞外泌体干预后的滑膜组织中相关蛋白表达量高于B 细胞，提示A细胞外泌体比B 细胞外泌体含有更多的促炎因子。外泌体主要携带来自母细胞的蛋白及其他物质，在KOA 中，A 细胞在损伤相关分子模式的刺激下不仅释放促炎因子，而且会释放多种黏附分子，如血管细胞黏附分子-1 等[23]；B 细胞是源于骨髓中的巨噬细胞，当局部产生炎症时，不仅出现B 细胞增殖，而且大量循环系统中的巨噬细胞在血管细胞黏附分子-1 的作用下被募集到滑膜组织中[24]，产生局部免疫反应，同时释放的炎症因子又可以进一步促进成纤维细胞增生和产生炎症[24-25]。可见在KOA 中，A 细胞是主要的炎症效应细胞，两种细胞不仅都会产生炎症因子，而且可以通过各自分泌的外泌体在两者之间形成正反馈调节，互相促进炎症程度导致KOA 的进一步加重。

综上，在KOA 疾病进展过程中，两种滑膜细胞外泌体均可以激活滑膜中TLRs/NF-κB 信号通路，加重KOA 的炎症程度。为进一步认识和研究KOA 发病机制提供了新的思路和研究基础。