张 昊,郑万祥,刘克普,侯广东,袁建林

(空军军医大学西京医院泌尿外科,陕西西安 710032)

根据2020年全球癌症统计数据,肾癌的发病率在男性和女性恶性肿瘤中分别是第9位和第14位[1]。其中,肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)约占肾细胞癌的70%[2]。转移性肾细胞癌(metastatic renal cell carcinoma,mRCC)是一种对化疗耐药的恶性肿瘤,随着分子生物学的进展,近十几年来有多种靶向药物可用于治疗mRCC。索拉非尼和舒尼替尼主要用于靶向抑制血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR),属于酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI),能改善mRCC的预后,但不同患者之间的生存获益程度差异较大,此外,TKI会引起各种毒副作用,包括增加致命不良事件的风险[3]。因此,为了选择适合特定治疗方法的患者,有必要发现更多与TKI治疗转移性肾透明细胞癌(metastatic clear cell renal cell carcinoma,mccRCC)预后相关的生物标志物。

CD10在肾素-血管紧张素系统中催化生成血管紧张素1-7,后者与Mas受体结合可抑制血管生成和肿瘤进展[4];HORIE等[5]发现CA9外泌体在体外能促进血管生成;有学者发现表达CD133的内皮细胞可以促进肿瘤新生血管的形成[6]。鉴于3种标志物均参与调节肿瘤血管生成,本研究旨在分析CD10、CA9、CD133表达与TKI一线治疗mccRCC预后的相关性,从而帮助泌尿外科医生进行临床决策和促进个体化治疗。

1 资料与方法

1.1 临床资料回顾性分析2007年1月-2017年12月在西京医院泌尿外科接受索拉非尼或舒尼替尼一线治疗的93例mRCC患者的资料。纳入研究的患者需符合以下条件：①经病理证实为mccRCC;②接受舒尼替尼或索拉非尼作为一线的靶向治疗;③有可用的甲醛固定、石蜡包埋的肿瘤组织标本;④有详细的随访信息。如果患者既往患有其他恶性肿瘤、组织标本有超过80%坏死或出血区域以及随访信息缺失,则排除于本研究之外,本研究最终纳入80例患者。根据患者治疗方法不同分为索拉非尼组(53例)和舒尼替尼组(27例)。根据实体瘤疗效评价标准(Response Evaluation Criteria In Solid Tumors,RECIST)1.1版判断疾病进展(progressive disease,PD),将无进展生存期(progression free survival,PFS)定义为从靶向治疗的第1天到出现影像学PD、出现明确PD临床证据或死亡之间的时间;如果PD日期未知,把最后1次随访时间定义为PFS删失的时间。总生存期(overall survival,OS)定义为从靶向治疗的第1天到死亡之间的时间。

1.2 免疫组织化学染色及染色强度分析将ccRCC组织标本制备成5 μm石蜡切片,而后进行免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色,所有原发肿瘤组织标本均来自西京医院病理科。IHC过程如下：把石蜡包埋的载玻片在分级脱蜡液中脱蜡,接着进行抗原修复,而后用体积分数为3%的双氧水溶液阻断内源性过氧化物酶,用体积分数为3%的牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA) 封闭切片后,将载玻片与一抗(抗CD10,1∶100,抗CA9,1∶600;抗CD133,1∶600)在4 ℃孵育过夜,然后在室温下孵育二抗(1∶200) 50 min,苏木精染色和脱水操作用于对细胞核进行反染色。通过全景切片扫描仪(Pannoramic MIDI,3DHISTECH,匈牙利) 采集IHC切片上的图像,并通过软件(Aipathwell,Servicebio Technology,中国) 进行分析,这款图像分析系统可自动识别组织测量区域,并评估阳性等级：阴性不着色,0分;弱阳性呈淡黄色,1分;中等阳性棕黄色,2分;强阳性呈棕褐色,3分。然后分析并计算阳性等级、测量区域中的组织区域面积、阳性面积等。对每个载玻片进行组织化学评分(H-score)以评估各标志物的染色强度,后基于各标志物H-score的中位数,将其区分为低表达或高表达,低于H-score中位数的为低表达,反之则高表达。H-score=∑(pi×i)=(弱阳性区域的百分比×1)+(中等阳性区域的百分比×2)+(强阳性区域的百分比×3)。pi代表阳性面积的百分比;i代表阳性等级(图1)。

A、B：CD10高表达和低表达;C、D：CA9高表达和低表达;E、F：CD133高表达和低表达。

1.3 统计学分析分析IHC标志物表达与临床病理变量的相关性,两组间计量资料以中位数(P25,P75)表示,比较采用Mann-WhitneyU检验,计数资料以例(%)表示,比较采用χ2检验;用单因素和多因素Cox比例风险模型分析mccRCC的预后因素;在索拉非尼和舒尼替尼亚组内,采用Kaplan-Meier法进行标志物表达与PFS和OS的生存分析,低表达和高表达间生存率的比较采用Log Rank检验。所有统计分析均由SPSS 25.0统计软件进行,作图软件用Graphpad Prism 9.0,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 患者的基本特征本研究共回顾性纳入80例mccRCC患者,其中索拉非尼组53例,舒尼替尼组27例(表1)。截至2022年7月,37例(46.25%)患者出现PFS随访结局,中位PFS(median PFS,mPFS)为24.9(95%CI：16.5～33.2)个月;有55例(68.75%)患者死亡,中位OS(median OS,mOS)为44.2(95%CI：14.6～73.7)个月。患者基本特征在药物组间的均衡性检验显示,手术方式为肾部分切除术(partial nephrectomy,PN)和根治性肾切除术(radical nephrectomy,RN)在药物组间分布差异有统计学意义(χ2=12.914,P<0.001)。

2.2 患者几种标志物表达与临床病理变量的相关性分析CD10表达与Fuhrman分级相关(χ2=6.241,P=0.012),在CD10低表达组,Fuhrman 3～4级mccRCC占比更高;CA9表达与淋巴结转移(χ2=5.952,P=0.015)和转移器官个数(χ2=8.205,P=0.004)相关,在CA9低表达组,有淋巴结转移和转移器官个数≥2个的患者占比更高,没有发现CD133与临床病理变量的相关性(表2)。

2.3 mccRCC预后的影响因素分析将年龄、性别、Fuhrman分级、T分期、转移器官数、转移部位、手术方式、药物种类及各标志物的表达等因素分别与PFS进行Cox单因素分析,结果显示,Fuhrman分级、转移器官数以及淋巴结转移是PFS的影响因素(P<0.05),将P<0.05的因素纳入Cox多因素分析中,显示Fuhrman分级是PFS的独立影响因素(HR=2.457,95%CI：1.126～5.365,P=0.024);同样方法对各因素与OS进行Cox回归分析,单因素分析显示转移器官数、淋巴结转移及CA9表达是OS的影响因素(P<0.05),而其中转移器官数是OS的独立影响因素(HR=1.857,95%CI：1.048～3.290,P=0.034,表3)。

表3 mccRCC患者PFS和OS的单因素分析

2.4 CA9表达与治疗亚组患者PFS和OS的生存分析Kaplan-Meier生存分析和Log Rank检验显示,在索拉非尼组内,CA9低表达和高表达组患者的mOS分别是25.4、79.7个月,OS的生存曲线差异有统计学意义(Log RankP=0.006),而两组间PFS生存曲线差异无统计学意义。在舒尼替尼组内,CA9低表达和高表达组间PFS和OS生存曲线差异均无统计学意义(图2)。

A、C：索拉非尼组CA9表达与OS(A)和PFS(B)的生存分析;B、D：舒尼替尼组CA9表达与OS(B)和PFS(D)的生存分析。

3 讨 论

2021年CSCO指南中指出舒尼替尼、索拉非尼是一线治疗转移性或不可切除性ccRCC的Ⅰ级推荐[7]。相较于索拉非尼或舒尼替尼的Ⅲ期临床试验结果[8-9],本研究中mccRCC患者的mPFS和mOS相对较长,原因可能来自两个方面。一方面是研究排除了失访的患者,而失访患者通常预后较差;另一方面是所纳入的患者都接受了PN或RN。既往回顾性研究显示,RCC患者在减瘤性肾切除术后接受靶向治疗较单纯靶向治疗具有显著OS获益[10]。

药物组间均衡性检验发现,索拉非尼组接受PN的患者仅3例(5.7%),明显低于舒尼替尼组。究其原因可能是索拉非尼组患者的发病时间早于舒尼替尼组。得益于医疗设备技术和循证医学的发展,接受PN的患者有逐年增多的趋势。一项研究回顾性分析了单中心在10年间接诊的1 498例RCC患者的资料,发现PN比例逐年提高,RN比例逐年降低[11]。有研究认为PN能有效地保存肾功能[12],降低心血管事件发生的风险[13],而接受RN或PN患者的肿瘤特异性生存率(cancer specific survival,CSS)并无明显差异[14]。

标志物表达与临床病理变量相关性分析发现,CD10低表达与Fuhrman高分级相关。与此发现一致的是,明少雄等[15]分析了1 084例ccRCC组织标本,发现CD10在细胞核高分化、中分化、低分化中的阳性表达率分别为81.1%、82.8%、50.0%,差异具有统计学意义(P=0.040)。这提示CD10低表达的mccRCC可能更容易发生疾病进展,有学者认为CD10表达缺失或减少可能会促进神经肽介导的细胞增殖和肿瘤进展[16]。CD10对ccRCC的预后作用尚存在争议。本研究未发现CD10表达与mccRCC患者PFS和OS的相关性。ERRARTE等[4]发现在ccRCC患者中,CD10阳性表达与更差的15年OS相关(P=0.007);另一研究发现在CD10阴性和阳性表达组之间,ccRCC患者的CSS生存曲线差异无统计学意义(P=0.361)[15]。

CA9低表达与淋巴结转移和转移器官数≥2相关,可能提示CA9低表达的ccRCC侵袭性更高。一项Meta分析研究发现,在RCC中CA9低表达与淋巴结转移和远处转移显著相关,并能预测较高的肿瘤分级[17]。ZHANG等[18]对730例接受手术治疗的ccRCC患者进行长期随访,中位随访时间为13.8年,发现CA9低表达与患者CSS降低相关(HR：1.62,P=0.001),但多因素分析没有发现显著相关性。本研究中,CA9低表达是mccRCC患者OS缩短的非独立预后因素。然而生存分析结果可能与CA9表达水平的界定标准有一定关系。CHAMIE等[19]对813例非转移性ccRCC患者的肿瘤组织进行CA9染色和H-socre评分,发现与CA9评分≤100分相比,CA9评分≥200分是PFS和OS独立且有利的预后因素。

CD133是五次跨膜糖蛋白prominin家族的成员,其表达在RCC中的预后作用存在争议。有Meta分析发现CD133高表达是RCC患者CSS独立且有利的预后因素(HR=0.4,95%CI：0.29～0.54)[20]。SAEEDNEJAD等[6]发现CD133的高胞质表达与ccRCC高分级、高分期、淋巴结转移显著相关,其膜性表达与肿瘤分级、分期不相关。而D’AlTERIO等[21]的一项研究评估了细胞质和细胞膜CD133的表达,发现CD133不是RCC患者无疾病生存期的预后因素(P=0.151)。本研究发现CD133不能作为mccRCC的预后因素,在进一步的研究中可分析胞膜或胞质表达其各自的预后作用。

治疗亚组内CA9表达与PFS和OS的生存分析表明,CA9高表达与索拉非尼组mccRCC患者较长的OS相关,而与PFS不相关。CHOUEIRI等[22]分析了TARGET研究中接受索拉非尼治疗的133例mccRCC患者的资料,CA9高表达与低表达患者的mPFS分别为5.5和5.4个月,差异没有统计学意义。在舒尼替尼治疗的ccRCC患者中,CA9的预后作用存在争议。本研究发现,CA9低表达与舒尼替尼组患者的OS和PFS均不相关。有学者前瞻性招募了67例接受舒尼替尼一线治疗的ccRCC患者,同样发现CA9表达不是PFS和OS的预后因素[23]。然而MA等[24]的研究发现,在52例接受舒尼替尼一线治疗的mccRCC中,CA9高表达组相较低表达组患者有较长的PFS和OS,差异有统计学意义。在本研究中,CA9低表达组患者从索拉非尼和舒尼替尼治疗中生存获益较少,因此对于肿瘤组织中CA9低表达的mccRCC患者,可以根据指南选择靶向免疫联合治疗或双免联合治疗以改善预后。

本研究存在一定局限性,首先,本研究为单中心的回顾性研究,存在一定偏倚,样本量相对较少,未来需要扩大样本量及前瞻性研究对本结论进行验证;其次,部分患者在疾病进展后换用不同的二线或三线药物治疗;第三,各研究所使用的抗体敏感性和规格各不相同,确定标志物阳性或阴性表达的标准也有所不同,可能会导致不同的结果。本研究仅纳入ccRCC患者,保证了数据的同质性,基于各标志物调节肿瘤血管生成的潜在机制,本研究可能是首个分析CD10、CD133与TKI治疗mccRCC预后相关性的研究,旨在协助临床医生精准决策。