黎玉琼，于有利*，从志鹏，郭亚男，薛峰

(1. 宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏 银川 750002；2. 西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712100；3. 南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095)

牛球虫病是一种由艾美耳属原虫引起的全球性疾病，给全球诸多国家的农场社区和畜牧业生产造成了巨大的经济损失。牛球虫病在许多国家被认为是一种常见病，可流行于不同阶段的牛群中，但在临床上主要影响1岁以内的小牛。该病主要是由于在短时间内摄入大量卵囊引起的，当机体抵抗力低下时更容易发生。初乳缺乏、放养密度高、营养不良等原因被认为是牛球虫病重要的诱发因素[1-4]。

艾美耳球虫是顶复动物亚门的专性细胞内寄生虫，主要侵袭肠上皮细胞并在其中繁殖。艾美耳球虫生命周期由内生的无性繁殖和有性发育组成[5]。无性繁殖是通过裂殖体产生裂殖子进行传代，寄生的细胞最后破裂并释放出细长的裂殖体，入侵周围的大肠黏膜细胞，在黏膜细胞中又分裂为更小的第二代裂殖体，随后是有性繁殖，第二代裂殖体又分裂为成熟雄配子母细胞和成熟雌配子母细胞。每个母细胞产生大约100个有活力的配子，从而形成合子。合子被包裹在保护壁中，形成了从宿主释放到外部环境中的卵囊[5]。寄生于牛体的各种球虫种属中，以牛艾美耳球虫和邱氏艾美耳球虫2种球虫致病力最强，且是最常见的，其他的艾美耳球虫也可引起较小程度的感染[6]。在临床上，对于球虫病的诊断主要根据牛艾美耳球虫形态学来鉴定种类，通过临床症状、肠道病变及球虫卵囊数(OPG)来鉴定球虫病[7-8]。本研究通过调查宁夏不同地区奶牛球虫病的流行状况并分析其潜在的相关危险因素，从而为奶牛球虫病的防控策略提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

小型台式离心机购自Eppendorf公司，饱和食盐水和离心管购自上海碧云天有限公司，40目铜丝网、60目铜丝网和麦氏虫卵计数板购自上海富雪生物有限公司，多功能电子天平等购自中国沈阳龙腾电子有限公司，奥林巴斯生物显微镜购自日本奥林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 样品采集

8 374份奶牛新鲜粪样，于2014—2022年按照不同月龄采集宁夏不同地区未进行驱虫的集约化奶牛场。采样方法为直肠采样或收集地面上刚排泄的新鲜粪便，采集的粪便保存于2.5%重铬酸钾溶液的离心管内，置于4 ℃保存，待检。

1.2.2 球虫卵囊计数

通过麦克马斯特法对球虫卵囊进行计数。取2 g粪样置于干净的100 mL烧杯内，加入8 mL饱和食盐水溶液，用玻璃棒捣碎混匀粪样，再加入50 mL饱和食盐溶液，混匀后立即用60目筛网过滤，吸取滤液充满2个计数室，在显微镜载物台上静置3～5 min，在10倍物镜下镜检计数。每个计数室内有100个方格(1 cm×1 cm×0.15 cm)。待分别查完2个计数室100个方格内的卵囊数量n1和n2，按照如下公式计算OPG[9]。

OPG=[(n1+n2)/(2×0.15)]×60/2。

1.2.3 球虫卵囊形态观察

按照之前文献描述方法[10-11]，收集保存镜检球虫卵囊阳性的粪样每份20 g，将粪样加入50 mL离心管中，加入适量水搅拌均匀。然后用40目和60目铜筛分别过滤，向过滤后的液体中加适量PBS缓冲液，于3 500 r/min离心15 min，弃去上清液。加入适量饱和食盐水，于2 000 r/min离心10 min，粪渣沉于管底，卵囊漂浮于饱和食盐水表面，用移液枪吸取10 μL上清液于载玻片上，加盖玻片后于40倍显微镜下观察卵囊形态。

1.2.4 统计分析

采用SPSS软件进行统计学分析，应用皮尔逊相关系数，确定气候参数(平均相对湿度、降水量、平均气温和平均地表温度)与感染率和均值的相关性。P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同年份奶牛球虫阳性率和感染虫种

对比不同年份奶牛球虫感染率，结果如图1所示，2014—2022年奶牛球虫平均感染率为35.90%。2014—2017年期间奶牛球虫病的发病率呈逐年增长趋势，2018—2019年呈下降趋势，2019—2020年呈上升趋势，2020—2022年呈下降趋势。共检出的12种艾美耳球虫，分别是亚球形艾美耳球虫、牛艾美耳球虫、邱氏艾美耳球虫、皮利他艾美耳球虫、柱状艾美耳球虫、阿拉巴艾美耳球虫、奥博艾美耳球虫、巴西艾美耳球虫、拔克朗艾美耳球虫、加拿大艾美耳球虫、椭圆艾美耳球虫和怀俄明艾美耳球虫(图2)。

括号中数值表示不同年份球虫阳性样品数/不同年份采集的样品总数。图1 2014—2022年奶牛球虫感染情况

A.亚球形艾美耳球虫；B.柱状艾美耳球虫；C.椭圆艾美耳球虫；D阿拉巴艾美耳球虫；E.邱氏艾美耳球虫；F.牛艾美耳球虫；G.加拿大艾美耳球虫；H.怀俄明艾美耳球虫；I.奥博艾美耳球虫；J.巴西艾美耳球虫；K.皮利他艾美耳球虫；L.拔克朗艾美耳球虫。图2 12种艾美耳球虫形态

2.2 不同月龄奶牛球虫病发病率、优势虫种及感染强度

如图3所示，0～6月龄犊牛球虫感染率呈明显增长趋势，7月龄育成牛较6月龄犊牛有所降低，8月龄育成牛较7月龄育成牛感染率再次上升，9～12月龄育成牛较8月龄育成牛感染率下降。另外，不同月龄牛的主要优势虫种不同，如图4所示，1、2、4、6、9和12月龄牛的优势虫种为牛艾美耳球虫，3月龄优势虫种为柱状艾美耳球虫，5月龄优势虫种为皮利他艾美耳球虫，7月龄牛优势虫种为亚球形艾美耳球虫，8月龄牛优势虫种为怀俄明艾美耳球虫，10月龄和11月龄牛优势虫种为巴西艾美耳球虫，总体分析牛艾美耳球虫为1岁以内牛的主要优势虫种。不同月龄牛感染的OPG也不同，其中7月份OPG最高为2 432，12月OPG最低为387(图5)。

括号中数值表示不同月龄球虫阳性样品数/不同月龄采集的样品总数。图3 不同月龄奶牛球虫病检测结果

图4 不同月龄牛的虫种变化

图5 不同月龄感染牛平均OPG

2.3 不同月份球虫病的发病率

如图6所示，不同月份艾美耳球虫感染率不同，其中球虫病高发月份主要基中在4—11月份，1—6月份呈上升趋势，7—12月份呈下降趋势。

括号中数值表示不同月份球虫阳性样品数/不同月份采集的样品总数。图6 不同月份球虫病感染率统计

2.4 球虫病的风险因素分析

如表1和表2所示，艾美耳球虫病感染率与平均相对湿度呈显著正相关(P<0.05)，与降水量、平均气温、平均地表温度呈极显著正相关(P<0.01)。

表1 不同月份气象数据分析结果

表2 不同因素与感染率相关性分析结果

3 讨论

牛球虫病是奶牛养殖过程中常见的一类肠道疾病，以出血性肠炎为主要临床症状，可导致严重腹泻、生长发育缓慢、生产性能下降，甚至死亡[12-13]。药物是控制球虫病的主要方式，但其使用存在着诸多问题[14]。近年来，在绿色养殖理念的指导下，减抗在养殖中得到深入的开展，但是由于尚未出现有效的替抗产品，集约化养殖中牛艾美耳球虫的发病率和死亡率也呈上升趋势[15-16]。

本研究于2014—2022年采集宁夏不同地区8 374份样本，发现2014—2017年球虫感染率呈上升趋势，主要是因为2014—2017年宁夏地区养殖户及科研人员对球虫病的认识不足，没有有效的诊断方法和及时的治疗。2018—2019年球虫感染率呈下降趋势，是因为随着大部分养殖企业和饲料公司对肠道寄生虫病认识的提高，莫能菌素等药物作为饲料添加剂进行饲喂。2019—2020年感染率再次升高，是因为2020年以来我国为了加强动物肉食品安全而推动的限抗、禁抗等工作，兽药端限抗，饲料中则完全禁止添加抗生素，因此造成了许多地区出现了球虫病暴发的情况，球虫感染率也明显提高。2020—2022年趋势有所下降，2020年以来，随着寄生虫相关知识进一步的普及和培训，养殖户对寄生虫感染的认识不断提高，通过提高圈舍卫生和增强动物机体免疫力而降低感染率。

本研究通过对不同月龄的粪样进行检查和分析，发现0～6月龄球虫感染率呈明显增长趋势，其中3～6月龄犊牛尤其易感。据走访调查发现，大部分养殖户缺乏科学合理的分群和饲养密度的意识，一般会根据犊牛个体大小的方法分群，断奶、混群应激、密度和分群跨度是球虫病感染的重要因素。正确的分群方法应是同一圈舍年龄跨度控制在1月龄以内。6～8月龄感染率虽是最高，但感染强度不大，因为此时牛体瘤胃菌群已建立，机体整体免疫力和抵抗力增强。9～12月龄的感染率虽呈现下降趋势，但是牛体长期带虫，持续向外界排泄卵囊，污染环境，不断增加牧场球虫感染压力。另外，不同月份感染率也不同，其中球虫病高发月份主要集中在4—11月份。为了探究其原因，本研究通过对宁夏地区不同月份平均气温、降水量、平均相对湿度、平均地表温度进行统计，发现了球虫感染率与平均相对湿度、降水量、平均气温和平均地表温度均呈显著正相关。因此，不同月份球虫病的发生主要与当年此月份的环境因素有关，尤其是降雨量、地表温度和平均气温。

综上所述，通过系统研究宁夏部分地区集约化奶牛场球虫病的流行病学特征以及影响球虫病发生的相关因素，初步揭示了宁夏地区奶牛中球虫潜在的公共卫生安全风险，为进一步制定针对球虫感染的高效防控方案提供依据。