谢欣怡，陈俊赫，王文浩

(1.山东农业大学生命科学学院，山东 泰安 271018；2.江苏农牧科技职业学院动物科技学院，江苏 泰州 225300)

肉品质受许多因素的影响，主要有环境和遗传两个大的方面。肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)，是动物体内一种重要的转化生长因子，该基因起源于转化生长因子-β(TGF-β)超家族[1]。该基因包含3个外显子和2个内含子，其前体由375个氨基酸组成[2]。它主要存在于肌肉组织中，在肌肉生长中发挥着重要的负调节作用，参与调节骨骼生长和脂肪沉积及代谢，甚至对肌腱和韧带的强硬度有一定影响[3-4]。该基因发生突变，可能导致肌细胞的过度生长以及肌纤维的肥大，直接影响畜禽生长性能。有研究表明，家畜由于该基因缺失或突变，可能表现出十分发达的“双肌性状”[5]。G→A突变错译是皮埃蒙特牛产生“双肌”现象的原因之一，由于机体基因表达的变化，不能合成正常的MSTN蛋白，导致体重增加[6]。Xu等[7]发现小鼠缺乏MSTN基因，肌肉明显增加，体重比野生小鼠大1倍。猪敲除MSTN基因后，除了能增加肌肉的质量外，随着年龄的增长，脂肪含量会明显降低[8]。研究还发现比利时蓝牛因MSTN基因发生移码突变，在缺失碱基后的第14个密码子开始，停止翻译[8]。Lee等[9]研究发现，当中年小鼠缺失MSTN基因后，肌肉增加显著，脂肪含量呈大幅度下降，这表明通过敲除MSTN基因可以减轻由于衰老引起的病理症状。

康乐黄鸡原产于江西省宜春市万载县康乐镇，有着1 500多年的养殖历史，表观特点是“脚黄、毛黄、皮肤黄”，易于饲养管理，温顺，耐粗饲，鲜嫩肉味[10-11]。目前关于康乐黄鸡MSTN基因的单核苷酸多态性(SNP)位点及其遗传表达规律、作用机制等研究尚未见报道。本试验旨在探讨康乐黄鸡MSTN基因第一外显子区域SNP，采用全血基因组提取和分子生物学的方法，对康乐黄鸡MSTN基因进行PCR扩增、测序、分析变异情况，研究其对康乐黄鸡上市体重性状的遗传效应，筛选出优良基因(分子标记)，为这一优良地方鸡种资源的保护以及开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验动物为180日龄生长状况良好的康乐黄鸡母鸡，试验样本量为200，饲养于宜春学院生态养殖基地。采用常规翅下静脉采血的方法，在无菌环境下操作，加入柠檬酸葡萄糖溶液(ACD)抗凝剂，制成1.5 mL抗凝血液，-20 ℃下保存备用。同时称取180 d上市体重，用于后续关联分析。

1.2 主要试剂

引物，抗凝剂ACD，耐热DNA聚合酶(Taq酶)，10 mmol/L的Tris-HCl Buffer，dNTPs，琼脂糖，DNA裂解液，75%乙醇，冰醋酸，氯仿-异戊醇(24∶1)，氨基丁三醇(Tris)，HCl，氨基丁三醇-乙二胺四乙酸(TE)溶液，3 mol/L 醋酸钠(pH=5.2)，异丙醇，TAE溶液，甘油上样缓冲液，核染料，0.1%巯基乙醇，0.05 mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)等试剂，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 康乐黄鸡血液采集及基因组DNA提取

对受试鸡进行DNA采集，采集鸡翅静脉血1 mL，并用ACD抗凝剂处理，存放于-20 ℃冰箱备用。采用天根生化科技(北京)有限公司血液基因组DNA提取试剂盒对试验鸡血液基因组DNA进行抽提，随后以超微量紫外分光光度计检测其浓度及质量。

1.4 琼脂糖凝胶电泳测定基因组

取DNA溶液5 μL，加入5 μL甘油上样缓冲液(已加核染)混匀，滴入点样孔点样。在90 V电压，60 mA左右电流下，电泳50 min，使用Image Lab核酸凝胶成像系统成像，观察条带分布并分析电泳结果。

1.5 设计MSTN基因引物

依据GenBank中cDNA文库所提供的鸡MSTN基因序列，在Primer 5.0软件中设计上下游引物。预计扩增片段大小为495 bp。引物序列为，MSTN-1s：5′-TTGCATTTGCAGTCACGGAT-3′；MSTN-1a：5′-ACGAAAGCAGCAGGGTTGTT-3′。

M. DNA Marker DL5000；1、2. 鸡基因组DNA；3.MSTN基因PCR扩增产物；红色标记为系统自动加强。图1 全血DNA与MSTN基因PCR扩增产物电泳

1.6 PCR扩增

PCR反应体系25 μL：18.0 μL ddH2O，2.0 μL dNTPs(10 μmol/L)，2.5 μL含有Mg2+的buffer(10 μmol/L)，上、下游引物各0.5 μL(10 μmol/L),模板DNA 1 μL，Taq酶 0.5 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共32个循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，Image Lab核酸凝胶成像系统观察分析电泳结果，拍照保存[12]。

1.7 数据统计与分析

利用SPSS 22.0软件进行群体等位基因频率分析、基因型频率分析、哈代温伯格平衡检验等，数据表示为“平均值±标准差”。

2 结果与分析

2.1 全血基因组电泳分析

Image Lab核酸凝胶成像系统显示目的条带明显清晰，分布集中，无弥散分离、拖尾、出现多重条带等不良现象(见图1A)，表明DNA提取成功，全血基因组完整，可用作后续PCR扩增模板。

2.2 扩增片段的电泳分析

使用Image Lab核酸凝胶成像系统分析PCR扩增MSTN基因的条带，结果如图1B所示。目的条带清晰明显，具有较强的特异性，产物片段大小在500 bp左右，符合预期，可用于后续分析。

2.3 扩增片段测序结果及比对分析

将扩增产物送于测序公司(安徽滁州通用生物公司)进行纯化，并双端测序，将测序结果与基因库中MSTN序列(GenBank登录号：NC_052538)进行BLAST在线比对，PCR扩增产物相似度超过99%，说明 PCR扩增产物的序列与目标序列相同。使用Chromas软件分析碱基突变情况，结果表明第一外显子中存在1个SNP位点，该突变位于7号染色体上252 542 bp处，该位点发生的突变是C→G突变(图2)。

2.4 不同基因型对康乐黄鸡体重的遗传效应分析

经过测序得到MSTN基因1个C→G突变，其中C、G等位基因频率以及其包含的3个基因型频率见表1。MSTN基因经哈代温伯格平衡检验，该群体χ2为1.03，该群体处于平衡状态。将试验的200个个体不同基因型上市日龄的康乐黄鸡体重进行分类，分析不同基因型个体间体重的差异程度(表2)，结果表明突变纯合子GG型的上市日龄体重显著高于CC纯合子以及CG杂合子(P<0.05)，CG与CC差异不显著(P>0.05)。

表1 MSTN基因C→G突变等位基因频率及基因型频率

表2 不同基因型与上市日龄康乐黄鸡体重性状的关联分析 g

3 讨论

生长特性一般受微效应多基因控制，微效多基因不仅受单个多态位点的影响，且还受多态位点之间聚合效应的影响。研究发现，MSTN基因与皮下脂肪厚度、肌肉重量、屠宰率等性状均有显著关联性[13-16]，而这些性状正是影响鸡上市体重性状的主要因素。目前关于MSTN基因SNP位点的研究有许多，包括猪、牛、羊、鸡等均有涉及。在鸡上研究发现MSTN基因突变对其生产性能的影响主要集中在第一外显子上：李维等[17]对赤水乌骨鸡 MSTN 基 因的外显子进行多态性检测，结果发现在赤水乌骨鸡MSTN基因的外显子1中检测到1个SNP位点C324T，得出MSTN基因对赤水乌骨鸡 pH 值和剪切力具有较大的遗传效应的结论；龙广丽等[18]在贵州地方白羽鸡种MSTN基因的第一外显子处筛查到6个SNPs，其中4个SNPs位点突变会导致基因mRNA二级结构的构象发生改变，可作为改良贵州地方白羽鸡肉质品质的分子遗传标记进一步研究；张贤娴等[19]研究发现，大恒肉鸡MSTN基因的第一外显子序列上有5个SNPs位点，且其中的4个位点对肉鸡的生长与与肉质有重要的影响；张丽等[20]以构建DNA混合池，通过分段扩增获得静宁鸡MSTN基因编码序列，并对其进行SNPs筛查和生物信息学分析的方法，发现静宁鸡MSTN基因编码区全长1 128 bp，编码375个氨基酸，该蛋白为亲水性蛋白，编码区共筛查到3个SNPs，均位于第一外显子(exon1),分别为exon1-c.60G>A、exon1-c.195C>G和exon1-c.234G>A。本试验对康乐黄鸡MSTN进行了基因多态性检测，筛选到的突变亦位于第一外显子区域，与上述文献吻合，该突变为C→G无义突变，通过突变体群里与原始群体的上市日龄体重比较分析发现突变纯合子GG型的上市日龄体重显著高于CC型和CG型，推测可能是由于该突变引起了基因组空间构像的改变，进而影响了基因的表达，最终影响了上市日龄的体重。该突变作为提高康乐黄鸡上市日龄体重的一个潜在分子标记，可以借助目前已在鸡上成功运用的基因编辑等新技术来进一步研究[21]。

4 结论

本试验使用PCR扩增的方法，测定康乐黄鸡MSTN基因的第一外显子区域的碱基序列，结果表明该区域存在一个SNP位点。这个SNP位点突变纯合子GG型的上市日龄体重显著高于CC型和CG型，可以作为康乐黄鸡后续品种改良潜在的候选分子标记，值得进一步研究。