吴婷婷 ，段振华 ，王春婷

1.贺州学院食品与生物工程学院（贺州 542899）；2.广西康养食品科学与技术重点实验室（贺州 542899）；3.广西科技大学生物与化学工程学院（柳州 545006）

柿为柿科柿属植物，是我国六大木本粮油树种之一[1]。我国种植地区广泛且拥有三千多年的种植历史，其中河南、河北、广西是我国三大种植区，总年产量约占全国年产量的50%[2]。我国柿果品种繁多，初步可以分为两类：一类是可以在树上自然脱涩并直接食用的甜柿；一类是无法在树上通过自身作用脱涩，需经过人工脱涩处理才可食用的涩柿[3]。恭城月柿，别名“水柿”，盛产于广西壮族自治区桂林市恭城瑶族自治县（简称恭城），是广西主要种植的特色涩柿品种，距今已有400多年栽培历史。因月柿品质上等，1996年恭城被授予全国唯一的“中国月柿之乡”称号，2000年，恭城月柿的优良品质让其好评如潮，被授予“中华名果”的美称[4]。同时，恭城月柿是一种药食同源的水果，不仅含有丰富的维生素C、胡萝卜素、糖类和蛋白质等营养物质及碘、钙、铁、磷等矿质元素，还含有大量抗氧化物质，如单宁、芦丁和黄酮类物质等，具有一定药用价值[5-6]。

恭城月柿营养丰富，是典型的呼吸跃变型果实，采摘后在鲜果贮存、保鲜和加工过程中极易发生酶促褐变反应，严重影响恭城月柿相关加工产品的风味和外观品质，制约了恭城月柿的深加工产业。多酚氧化酶（PPO）广泛存在于果蔬的组织细胞中，是一类含有辅基铜离子的结合酶[7]。很多研究表明PPO的激活会引起酚类物质的氧化和聚合，是果蔬酶促褐变的主要原因之一[8]，且不同果蔬中PPO的酶学特性也各有差异。因此，为阻止酶促褐变对加工产品产生的不良影响，恭城月柿PPO酶学特性的相关研究是恭城月柿采后加工的研究重点。

国内外学者对许多水果中PPO的酶学特性进行相关研究，如苹果[9]、芒果[10]、桃[11]和柠檬[12]等。但是对于恭城月柿，很少有关其PPO的酶学特性及控制措施的报道。因此，以广西恭城月柿为试验材料，研究其PPO的酶学特性，以及3种酶抑制剂对PPO酶活性的影响效果，以期为恭城月柿采后生产加工过程中的酶促褐变控制及机理研究提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验原料

恭城月柿（市售）。

1.2 仪器与试剂

PTX-FA11OS型电子天平（福州华志科学仪器有限公司）；A11型微型粉碎机（德国IKA集团）；P1200S型数显高速分散均质机（湖南力辰仪器科技有限公司）；HH-S2型数显恒温水浴锅（江苏金怡仪器科技有限公司）；UV-1780型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；KQ3200DE型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；5804R型台式高速冷冻离心机（德国艾本德股份公司）。

愈创木酚、聚乙烯吡咯烷酮、邻苯二酚、冰醋酸、乙酸钠、盐酸、氢氧化钠、过氧化氢、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、抗坏血酸、柠檬酸、亚硫酸氢钠（均为分析纯）。

1.3 方法

1.3.1 恭城月柿PPO粗酶液的提取

参考Qi等[13]的方法并略有修改。将新鲜的恭城月柿清洗、削皮后，用液氮速冻后快速研磨呈粉末状，放置于-80 ℃超低温冰箱中贮藏备用。称取1 g恭城月柿粉末，加入6 mL 0.1 mol/L pH 5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液（溶液中含有1%的聚乙烯吡咯烷酮），振荡摇匀后在冰浴条件下静置提取10 min，在4 ℃以10 000 r/min离心20 min，所得上清液即为PPO粗酶液，放入4℃冰箱中保存，并在12 h内完成PPO酶活性的测定。

1.3.2 恭城月柿PPO酶活性的测定

PPO酶活性的测定采用邻苯二酚法[13]。0.05 mol/L的邻苯二酚溶液提前用pH 5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解配制。取2.9 mL 0.05 mol/L的邻苯二酚溶液，加入0.1 mL PPO粗酶液组成反应体系，迅速启动反应，在室温下反应15 s后于波长410 nm处测定吸光度。每隔30 s记录1次，共测定3 min。空白对照采用蒸馏水代替邻苯二酚，以每分钟吸光度变化0.01为1个酶活力单位U，最后活力值表示为U/g。试验重复进行3次。

1.3.3 底物浓度对恭城月柿PPO酶活性的影响

分别用pH 5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液配制浓度为0.01，0.02，0.03，0.04和0.05 mol/L的邻苯二酚溶液。分别取2.9 mL各浓度邻苯二酚溶液，加入0.1 mL PPO粗酶液，在室温下反应15 s后于波长410 nm处测定吸光度。

1.3.4 pH对恭城月柿PPO酶活性的影响

分别配制pH 3.5，4.5和5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液，pH 6.0，6.5，7.0，7.5和8.0的磷酸盐缓冲液，用上述不同pH的缓冲液配制浓度0.05 mol/L的邻苯二酚溶液作为反应底物。分别取2.9 mL各pH的0.05 mol/L的邻苯二酚溶液，加入0.1 mL PPO粗酶液，在室温下反应15 s后于波长410 nm处测定吸光度。

1.3.5 温度对恭城月柿PPO酶活性的影响

浓度0.05 mol/L的邻苯二酚溶液提前用pH 5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解配制。取2.9 mL 0.05 mol/L邻苯二酚溶液，加入0.1 mL PPO粗酶液组成反应体系，快速摇匀反应体系，分别在20，25，30，35，40，45，50，60，70和80 ℃于波长410 nm处测定吸光度。

1.3.6 不同抑制剂对恭城月柿PPO酶活性的影响

在1.3.2的反应体系中分别加入0.2 mL不同浓度的亚硫酸氢钠溶液（1，5和10 mmol/L）、抗坏血酸溶液（1，5和10 mmol/L）和柠檬酸溶液（1，5和10 mmol/L），在室温下反应15 s后于波长410 nm处测定吸光度。PPO相对酶活性以初始酶活力为100%，不同抑制处理下测得的酶活力与初始酶活力的比值[14]。

1.4 数据处理

试验数据使用Excel软件进行处理分析，利用SPSS 19.0软件进行方差分析，采用Duncan法进行统计学分析，采用Origin 2021 Pro软件进行绘图，数据以平均值±标准差表示，并以干基计算。

2 结果与讨论

2.1 底物浓度对恭城月柿PPO酶活性的影响

底物浓度对恭城月柿PPO酶活性的影响如图1所示。恭城月柿PPO酶活性与底物邻苯二酚溶液的浓度息息相关，PPO酶活性随着邻苯二酚浓度的增加而呈现增大的趋势，邻苯二酚浓度0.03 mol/L时PPO酶活性达到最大，最大值为47.43 U/g。而刺梨PPO的最适底物浓度为0.1 mol/L[15]，杏PPO的最适底物浓度为0.067 mol/L[16]，这表明不同水果PPO反应时的最适底物浓度各有差异。随着邻苯二酚溶液浓度继续增加，PPO酶活性不再增大，反而呈现稳定的趋势。产生这种现象的原因可能是底物浓度过低时，PPO粗酶液中只有部分酶分子能与底物结合发生酶促褐变反应。随着底物浓度的增加，越来越多的酶分子可与底物结合反应，酶分子与底物的结合达到饱和状态，此时酶活性达到最大值，进一步增加底物浓度也不能提高PPO酶活性[17]。

图1 底物浓度对恭城月柿PPO酶活性的影响

2.2 pH对恭城月柿PPO酶活性的影响

图2描述pH对恭城月柿PPO酶活性的影响。在不同pH的缓冲液下恭城月柿PPO酶活性变化明显，说明PPO酶活性对反应环境的酸碱性很敏感。pH在6.0～7.0时，PPO酶活性较高，pH 6.5时PPO酶活性达到最大，因此，恭城月柿PPO酶的最适pH为6.5，这与文献中报道的PPO最适pH[18-19]一致。pH低于6.0或高于7.0时，PPO酶活性急剧下降，且在pH 3.5时PPO酶活性极低，这说明酸性或碱性过强的环境都不利于PPO与底物结合发生反应。PPO酶活性的下降可能与其本身的结构有关。PPO是一类含铜蛋白质，辅基铜在较强的酸性条件下会以铜离子的形式解离出来，从而导致PPO的变性失活；而在较强的碱性条件下，辅基铜又会与碱性溶液中的氢氧根离子结合形成不溶性的氢氧化铜，进一步促使酶活力显著降低[20]。由于反应环境酸碱性严重影响恭城月柿PPO的酶活性，所以在恭城月柿的生产加工过程中可通过控制反应环境的酸碱性抑制PPO酶活性，进而有效控制酶促褐变。

图2 pH对恭城月柿PPO酶活性的影响

2.3 温度对恭城月柿PPO酶活性的影响

图3反映不同温度下，恭城月柿PPO酶活性的强弱。恭城月柿PPO的最适反应温度为25 ℃，而苹果PPO[21]的最适反应温度为35 ℃，桃金娘PPO[22]的最适反应温度为30 ℃，这说明不同果蔬PPO的适宜反应温度存在差异。同时，随着温度的升高，恭城月柿PPO酶活性呈现先增加后减小的趋势，温度25 ℃时PPO酶活性达到最大值53.72 U/g，温度80 ℃时PPO酶活性基本消失。这主要是由于PPO的本质是蛋白质，高温会导致蛋白质的二级组织重排和三级组织断裂，进而导致PPO变性失活[23]。在实际生产加工过程中，如果选用高温手段使PPO失活，则应选择80 ℃以上的温度。

图3 温度对恭城月柿PPO酶活性的影响

2.4 不同抑制剂对恭城月柿PPO酶活性的影响

不同浓度的亚硫酸氢钠、抗坏血酸、柠檬酸溶液对恭城月柿PPO酶活性的抑制影响如表1所示。结果显示，3种酶抑制剂对PPO酶活性均有抑制作用，其中抗坏血酸对PPO酶活性的抑制作用最强，亚硫酸氢钠对PPO酶活性有明显的抑制作用，而柠檬酸对PPO酶活性的抑制作用较弱，这与朱金霞等[24]对枸杞鲜果的研究结果相似。抗坏血酸对PPO的抑制作用在于抗坏血酸与PPO结合后，PPO的α-螺旋和β-折叠结构减少，从而显著改变PPO的二级结构[25]。从表1中还可以看出，恭城月柿PPO相对酶活性随着抗坏血酸浓度的升高而减小，抗坏血酸浓度增大到10 mmol/L时，PPO相对酶活性仅有8.1%，极大抑制了PPO酶活性；随着亚硫酸氢钠和柠檬酸浓度的增大，对PPO酶活性的抑制效果越明显。虽然亚硫酸氢钠也能明显抑制恭城月柿PPO活性，但是亚硫酸盐及其分解产物SO2对人体健康有害，亚硫酸氢钠在食品中的使用有严格的限制[26]。而抗坏血酸是人体必需的营养物质，同时是国标允许在鲜果加工过程中使用的食品添加剂[27]，被广泛用于果蔬贮藏加工中，如各种果汁、罐头的色泽保鲜等[28]。因此，在恭城月柿采后的生产加工过程中可通过添加抗坏血酸抑制PPO的酶活力，抑制酶促褐变的发生。

表1 不同抑制剂对恭城月柿PPO酶活性的影响（±s，n=3）

表1 不同抑制剂对恭城月柿PPO酶活性的影响（±s，n=3）

3 结论

试验研究反应条件和3种抑制剂对恭城月柿PPO酶活性的影响。结果表明，以邻苯二酚为底物，恭城月柿的最适底物浓度0.03 mol/L，最适pH 6.5，最适反应温度25 ℃。3种酶抑制剂对PPO活性均有抑制作用，抗坏血酸的抑制效果最好，亚硫酸氢钠的效果次之，柠檬酸的抑制效果最差。其中，浓度10 mmol/L时的抗坏血酸可使恭城月柿多酚氧化酶丧失90%以上的酶活力。试验明确恭城月柿PPO的酶学特性，为恭城月柿深加工中酶促褐变的控制提供一定理论依据。