刘芳芳,陈红林,刘 峰,许晓军,黄福勇,楼 宝,钱豪杰

(1.浙江海洋大学 水产学院,浙江 舟山 316022; 2.浙江省农业科学院 水生生物研究所,浙江 杭州 310021; 3.浙江省海宁市鸿海养殖有限公司,浙江 海宁 314400)

十足目是甲壳纲中种类最丰富的一个目,现存物种14 000余种[1],在水环境中占有重要的生态位,其中包含的多种虾蟹类动物是我国经济水产品种的重要组成部分。染色体核型分析可以揭示染色体数量、大小和形态等基础遗传信息。分析物种的染色体核型信息是开展许多应用研究的基本前提,对了解生物的遗传组成、遗传变异规律、发育机制等有重要意义[2]。然而,相较于其他水产动物,关于虾蟹类动物核型的研究相对较少。这主要是由于十足目动物的染色体数目庞大[3],平均为2n=125[4],许多物种的染色体数目达到180条以上,如克氏原螯虾(Procambarusclarkii,2n=188)[5-6]、日本黑螯虾(Cambaroidesjaponicus,2n=196)[7]、破坏者螯虾(Cheraxdestructor,2n=188)[8]、亚太螯虾(Astacustrowbridgii,2n=376)[9]等,其中,亚太螯虾是十足目中迄今报道的染色体数目最多的物种。庞大的数目给十足目动物的染色体计数带来很大困难,这也是导致十足目动物二倍体数目占比普遍偏低的原因之一。不仅如此,十足目动物的染色体形态还很微小,通常不超过4 μm[10],难以获得形态清晰的中期分裂相,得到的染色体大多呈点状[11]、块状[12]或棒状[13-15],这些都加大了染色体核型制备和分析的难度,致使很多虾蟹类的核型研究发展较为缓慢。

红螯螯虾隶属于节肢动物门甲壳纲十足目,自1992年作为一种淡水经济虾类引进我国后[16],因其生长速度快、适应性强、养殖效益高而逐渐成为养殖新宠。红螯螯虾的营养丰富,出肉率高,市场需求旺盛,有着良好的发展前景[17]。红螯螯虾具有十足目动物染色体的典型特征,染色体制备困难。Tan等[18]对雄性红螯螯虾的核型进行了研究,指出其染色体数目为200,染色体长度均小于4 μm,但未对雌性红螯螯虾的染色体核型进行分析,无法比较雌、雄红螯螯虾的染色体核型。

本研究以红螯螯虾的肝胰腺组织和精巢组织为材料,采用低渗和空气干燥的方法制备染色体标本,对雌、雄红螯螯虾染色体的长度、臂比等核型数据进行分析,比较雌、雄间的染色体核型差异,更新红螯螯虾的核型数据,旨在丰富红螯螯虾细胞遗传学的研究基础和十足目动物染色体核型信息,为推进红螯螯虾遗传育种工作提供数据参考。研究内容对十足目其他动物染色体核型研究工作的开展亦有借鉴和启发价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

研究所用的红螯螯虾个体采自浙江省海宁市鸿海养殖有限公司,取体重25～35 g的雌、雄虾各15只用于实验,养殖温度为25 ℃,早、晚各投喂人工配合饲料(天邦全熟化龙虾饲料)一次。

实验试剂主要包括:植物血凝素(PHA),上海新国卫医疗器械有限公司;秋水仙素,生工生物工程(上海)股份有限公司;甲醇、冰乙酸,上海麦克林生化科技股份有限公司;瑞氏-吉姆萨染色液,珠海贝索生物技术有限公司。

实验仪器主要包括TD5B型低速离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)和DM4B型正置荧光显微镜(德国徕卡)。

1.2 实验方法

1.2.1 染色体制备

参照石林林等[6]的染色体标本制备方法,选取红螯螯虾肝胰腺和精巢组织用于染色体制备。设置秋水仙素处理时长分别为2.5、3.0、4.0 h,其他制备条件相同,观察比较不同处理时长下的中期染色体形态,筛选出秋水仙素最佳作用时长。

1.2.2 染色体数据处理

选取有丝分裂中期相,在Adobe Photoshop 2020 21.2.0软件中观察、统计染色体数目。选取形态良好、图像清晰的雌、雄红螯螯虾染色体有丝分裂中期相,使用Image J软件测量每条染色体的臂长,计算相对长度和臂比(长臂长度与短臂长度之比)。根据Levan等[19]的计算标准和命名法将染色体分为4组,即中部着丝粒染色体(m)、亚中部着丝粒染色体(sm)、亚端部着丝粒染色体(st)和端部着丝粒染色体(t),每组核型对应的臂比范围分别为1.00～1.67、>1.67～3.00、>3.00～7.00、>7.00。

2 结果与分析

2.1 制备条件筛选

观察并比较秋水仙素不同处理时长条件下的有丝分裂中期染色体形态,发现当处理时长为4.0 h时,可以观察到较多的点状染色体,当处理时长为2.5、3.0 h时均可获得染色体形态较好的有丝分裂中期相。从秋水仙素不同作用时长条件下获得的分裂相中选择可以代表该条件下较多染色体形态的分裂相进行观察与比较(图1)。

图1 秋水仙素处理2.5 h(A)、3 h(B)、4 h(C)后染色体的形态Fig.1 Chromosome morphology after 2.5 h (A), 3 h (B) and 4 h (C) colchicine treatment

2.2 雌、雄红螯螯虾的染色体数目

本研究成功地从12只红螯螯虾中获得分裂相,其中,在雌、雄肝胰腺组织中均获得有丝分裂相,从雄性精巢组织中获得减数分裂相。经统计,本研究分别获得雌、雄红螯螯虾肝胰腺的有丝分裂中期相和雄性精巢组织减数分裂中期相各36个。雌性和雄性红螯螯虾有丝分裂的染色体数目范围存在一定差异(图2),分别为190～206、200～207,两者的众数均为200,分别占39.3%、50.0%。雄性精巢组织减数分裂中期相中,二价体数目在94～104(图3),众数为100,占比50%。将出现频率最高的染色体数目定为二倍体染色体数目,则红螯螯虾的染色体数为2n=200。

图2 雄、雌红螯螯虾肝胰腺染色体数目分布Fig.2 Chromosome number distribution of hepatopancreas in male and female Cherax quadricarinatus

图3 红螯螯虾精巢染色体数目分布Fig.3 Spermatic chromosome number distribution of Cherax quadricarinatus

2.3 雌、雄红螯螯虾核型分析与比较

从雌、雄红螯螯虾中各选出一个数目完整、形态良好的有丝分裂中期相(图4)进行核型分析,测量分裂相中各染色体的臂长,计算臂比,将染色体长度和臂比最相近的染色体配对,最后按照同源染色体长度递减的顺序排列,分别构建雄性(图5)和雌性(图6)红螯螯虾的染色体组型,其核型公式均为n=100=36(m)+33(sm)+14(st)+17(t)。

图4 雄性(A)、雌性(B)红螯螯虾有丝分裂中期相和雄性减数第一次分裂中期相(C)Fig.4 Metaphase mitotic chromosome of male (A), female (B) Cherax quadricarinatus and meiosis first division metaphase chromosome (C)

m,中部着丝粒染色体;sm,亚中部着丝粒染色体;st,亚端部着丝粒染色体;t,端部着丝粒染色体。下同。m, Central centromere; sm, Subcentral centromere; st, Subterminal centromere; t, terminal centromere. The same as below.图5 雄性红螯螯虾核型模式图Fig.5 Karyotype pattern of male Cherax quadricarinatus

图6 雌性红螯螯虾核型模式图Fig.6 Karyotype pattern of female Cherax quadricarinatus

取每对同源染色体长臂和短臂的平均值作为同源染色体臂长数据,计算同源染色体长度、相对长度和臂比。雌、雄红螯螯虾分别对应100组数据,将统计结果整理于表1。比较雌性、雄性红螯螯虾的染色体长度数据发现,雄性红螯螯虾的染色体平均长度(1.28 μm)大于雌性(1.09 μm),雄性红螯螯虾的染色体长度分布范围(0.16～3.65 μm)也大于雌性(0.25～2.67 μm),雄性和雌性红螯螯虾染色体的相对长度范围分别为0.1%～2.9%、0.2%～2.4%。对比雌、雄红螯螯虾染色体的臂比数据发现,雄性红螯螯虾sm型染色体的臂比范围(1.709～2.963)与雌性(1.735～2.968)相近,雄性红螯螯虾m型染色体的臂比范围(1.117～1.596)与雌性(1.052～1.639)相当。在st型分组中,雄性的臂比范围(3.024～4.710)略小于雌性(3.042～5.507)。独立样本t检验结果显示,雌、雄红螯螯虾的染色体长度与各组型染色体长度均无显著差异(P>0.05),染色体臂比与各组型染色体臂比也均无显著差异(P>0.05)。

为了更直观地比较每条染色体的长度,将雄性和雌性红螯螯虾染色体的长臂和短臂用柱形图展示(图7、图8)。计算100对同源染色体的长度标准差,雄性的为0.67,雌性的为0.43,可知雌性染色体长度的离散程度更小,染色体长度分布更集中,数值变化更稳定。在各组型中,雄性的最大染色体长度均大于雌性。雌、雄红螯螯虾的最大染色体分别为m型和sm型,长度分别为2.67、3.65 μm,最小染色体均为t型,长度分别为0.25、0.16 μm。雌、雄红螯螯虾的染色体长度均小于4 μm。

正向长度表示染色体短臂,负向长度表示染色体长臂,0表示染色体着丝粒位置。图8同。The positive length represents the short arm of chromosome, the negative length represents the long arm of chromosome, and 0 represents the centromere position of chromosome. The same as in Fig. 8.图7 雄性红螯螯虾各染色体的长度Fig.7 Chromosome length of male Cherax quadricarinatus

图8 雌性红螯螯虾各染色体的长度Fig.8 Chromosome length of female Cherax. quadricarinatus

3 讨论

3.1 染色体制备

在染色体核型制备过程中,为了获得大量的有丝分裂相和减数分裂相,通常会选取细胞快速分裂状态下的组织[15]。在虾蟹类动物中,使用精巢[12,20]、受精卵[13]、触角腺[20]和肝胰腺[21]等组织均可获得较好的效果。Tan等[18]从红螯螯虾精巢组织中获得了有丝分裂和减数分裂中期相。本研究选用红螯螯虾肝胰腺和精巢组织进行染色体制片,在肝胰腺组织中获得大量有丝分裂相,在精巢组织中获得减数分裂相。减数分裂相的染色体数目较少,统计更为精确,统计结果符合有丝分裂相中染色体数目的一半,说明本研究中红螯螯虾染色体数目的统计结果可靠。

通过调整秋水仙素作用时长,发现当秋水仙素用量为5 μg·g-1(以虾体重计),作用时长为2.5～3 h时,可获得形态良好的中期分裂相,并从中选出了形态良好、着丝粒可辨的雌、雄红螯螯虾有丝分裂中期染色体进行测量和统计,使得雌、雄个体间染色体核型的比较结果更加客观,更具说服力。

3.2 红螯螯虾染色体核型

理论上,以出现百分比大于85%的众数为该物种的染色体数[10],然而在十足目染色体数目的研究中往往不能满足该要求,在已报道的部分十足目动物,如南美白对虾(Penaeusvannamei,2n=88)[22]、加州对虾(Penaeuscaliforniensis,2n=88)[22]、日本绒螯蟹(Eriochierjaponica,2n=146)[14]、中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis,2n=146)[14]中,二倍体染色体数目占比均在35%～70%。在染色体数目更多的十足目动物中,二倍体数目占比甚至更低,如克氏原螯虾(2n=188)二倍体数目占比为25.6%[6]。奥斯塔欧洲螯虾(Astacusastacus,n=88)和东欧螯虾(Astacusleptodactylus,n=90)的单倍体数目分别占40%和35%[23]。本研究中,雌、雄红螯螯虾二倍体数占比分别为39.3%、50.0%,单倍体数占比为50%,高于前述奥斯塔欧洲螯虾和东欧螯虾的研究结果,稍低于已报道的红螯螯虾单倍体数目(54.4%)[18]。本研究中,有27.8%的染色体数目小于二倍体数。造成这种结果的原因可能是染色体在制备过程中丢失,比如固定液和低渗溶液的交换过程、悬浮液滴片过程等。此外,染色体扩散时的重叠分布也会导致观察到的数目小于实际数目[24]。

本研究获得的雄性染色体核型与已报道的核型结果[18]存在较大差异,本研究中雄性个体的m组和sm组分别比已报道的多3对和8对,st组染色体数目相同,相应地,t组染色体则少11对。分析其可能的原因在于,制备条件不同影响染色体的皱缩程度,使得皱缩程度较大的染色体着丝粒位置难以确定,进而影响观察结果。制备着丝粒位置可辨的染色体中期分裂相是获得准确核型信息的关键。本研究表明,染色体皱缩程度受到秋水仙素用量和作用时长的影响,当秋水仙素用量为5 μg·g-1时,作用时长2.5～3.0 h可获得形态良好的有丝分裂中期相。已报道的红螯螯虾染色体是经2 μg·g-1秋水仙素作用5.0～6.0 h[18]得到的有丝分裂中期染色体。经过观察、比较两项研究中的有丝分裂中期分裂相和核型模式图,发现本研究中着丝粒位置可辨别的染色体数目更多,染色体形态相对更为舒展,更多地呈现为“X”状、倒“Y”状和倒“V”状,点状染色体较少,更利于确定染色体分组,因此核型分组结果准确性更高。此外,本研究中雄性和雌性红螯螯虾的染色体核型分组结果一致,也增加了本研究结果的准确性和可信度。

二价体由同源染色体发生联会两两配对而成,形状呈环状、十字状和哑铃状。哑铃状结构是甲壳类动物二价体的典型特征[10]。二价体数目是有丝分裂染色体的一半,降低了染色体计数的难度。在一些核型研究中,为了便于确定染色体数目,通常选择精巢组织,以获得数量减半的减数分裂中期染色体[25-27]。本研究在精母细胞第一次减数分裂中期获得二价体,统计结果显示其染色体数目为有丝分裂的一半。相对于减数分裂,二价体具有便于统计染色体数目的优势;但有丝分裂中期获得的染色体的优势在于更易观察形态特征,更适合对染色体大小和形态进行分析。

4 结论

本研究分别统计了雌、雄红螯螯虾有丝分裂中期和雄性第一次减数分裂中期的染色体数目,确定了红螯螯虾的二倍体染色体数目为2n=200、单倍体染色体数目为n=100。经分析雌、雄个体有丝分裂中期染色体的核型数据,确定核型公式为n=100=36(m)+33(sm)+14(st)+17(t)。雌、雄红螯螯虾染色体在大小和形态上无显著差异,未发现异形染色体。