邹文腾,刘振红,杨靖璇,陆阳阳,彭开松

(安徽农业大学 动物科技学院,水产养殖健康与公共卫生实验室,安徽 合肥 230036)

大口黑鲈(Micropterussalmoides)俗名加州鲈,属鲈形目(Perciformes)鲈亚目(Porcoidei)太阳鱼科(Cehtrachidae)黑鲈属(Micropterus),原产于北美密西西比河流域,自20世纪80年代引入我国后,因其生长快,肉质好,是我国重要的淡水养殖鱼类[1]。维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)属于气单胞菌科(Aeromonuduceue),气单胞菌属(Aeromonas),其中部分菌株是条件致病菌,可感染人、畜禽、鱼等多种动物,给公共卫生和水产养殖造成严重影响[2-3]。致病性维氏气单胞菌在地表水、土壤、气溶胶和患病动物内脏中均有分离[4]。作为一种条件致病菌,其可以导致水产动物的暴发性疾病,也可引起人类腹泻和菌血症[5-6]。

根据已公布的维氏气单胞菌菌株全基因组信息[7],可以探讨维氏气单胞菌的致病机制和耐药机制,揭示病原特殊信息、致病性、毒力因子和耐药基因等[8-9],为其病原生物学研究奠定了坚实基础。本研究对一株致病性维氏气单胞菌AV040株,进行全基因组测序,分析其致病性和耐药性的表型和基因型,加深了对维氏气单胞菌病原学的理解。

1 材料与方法

1.1 试验材料

患鱼样品采自安徽省滁州市定远县某渔场。体重为(10±1)g,体长平均(9±1)cm。试验用健康大口黑鲈鱼苗体重平均(10±1)g,体长平均(9±1)cm,由安徽省滁州市定远县徽海辉水产养殖有限公司(海大集团百容种业定远基地)提供。试验用健康4周龄小鼠,平均体重为(20±2)g,购自安徽医科大学实验动物中心。

脑心浸液肉汤培养基(BHI)购自索莱宝,革兰氏染色试剂盒、细菌生理生化鉴定管、32种药敏纸片购自杭州微生物有限公司,细菌16S rDNA测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 病原菌分离纯化

从患病鱼的脾脏和肾脏分离病原菌,分离纯化方法参考文献[10]。

1.3 回归感染试验

试验用健康大口黑鲈鱼苗在500 L体积水缸内25 ℃驯养2周,期间正常通氧和投喂。试验用健康4周龄小鼠暂养1周,其间正常投喂和更换洁净垫料。确定试验动物健康后进行回归感染。攻毒前24 h,试验鱼禁食,试验小鼠禁食和禁水,AV040攻毒浓度为1×108CFU·g-1,将临死个体进行剖检和细菌分离鉴定。

1.4 AV040株形态观察及生化特征测定

纯化后的菌株28 ℃培养24 h,观察菌落形态;挑取单菌落进行革兰氏染色、划线血平板和测定生化指标。

1.5 AV040株16S rDNA基因序列测定及系统发育学分析

16S rDNA PCR扩增产物送至上海生工生物工程股份有限公司测序,序列通过BLAST进行序列比对。在NCBI下载气单胞菌属的其他菌株和其他菌属的16S rDNA,使用MEGA 10.0的NJ法构建系统进化树。

1.6 全基因组测序及分析

全基因组测序由上海欧易生物医学科技有限公司完成。采用三代PacBio和二代Illumina进行全基因组测序;Qubit 3.0和Agilent 2100检测文库质量;falcon进行有效数据矫正和基因组初步组装;prodigal(v2.6.3)预测编码基因,RNAmmer V1.2 和tRNAscan-SE分别预测rRNA和Trna;蛋白质直系同源簇(Cluster of Orthologous Groups of Proteins, COG)注释基因功能和功能分类;基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)注释基因功能和通路分析。

1.7 AV040株对株对鱼和小鼠致病力的表型与基因型分析

维氏气单胞菌AV040在BHI中28 ℃培养至对数期,使用灭菌PBS将菌悬液调至1×107、1×108、1×109、1×1010和1×1011CFU·mL-1。大口黑鲈(每组10尾)和小鼠(每组5只)分别腹腔注射0.1 mL和0.2 mL各浓度菌液;对照组注射等量灭菌PBS。攻毒期间饲养温度为(25±1)℃,正常投喂,观察7 d,记录每日死亡量、临床体征及剖检病变。Reed-Muench法计算LD50。通过毒力因子数据库(Virulence Factors Database, VFDB)分析E105的毒力基因。

1.8 AV040株对抗生素耐药性的表型与基因型分析

采用K-B纸片扩散法进行药敏试验,参照文献[11]。通过抗生素耐药性数据库(The Comprehensive Antibiotic Resistance Database, CARD, https://card.mcmaster.ca/)分析耐药基因。

2 结果与分析

2.1 鱼体病症

患鱼体表出现溃烂,创口泛白,解剖观察发现鱼体中少血、贫血;肝胰脏发白,有白色坏死灶;脾脏微肿;肠炎,肠壁薄,内有淡黄色液体(图1)。

A,体表溃烂;B,肝脏白点。A, Body surface ulceration; B, White spots on the liver.图1 鱼体病症Fig.1 Fish illness

2.2 细菌分离及回归感染

从自然发病大口黑鲈的脾肾中共分离到10株菌。经人工感染,各株菌对大口黑鲈均具有致病性,且AV040株致病性最强,出现胸、腹鳍和肛门出血(图2-A),肝、脾和幽门垂等内脏出血(图2-B、C)。

A,胸、腹鳍和肛门出血(箭头); B,鳃出血、脾脏肿大(箭头); C,肝脏、幽门垂出血(箭头)。A, Bleeding from pectoral and ventral fins and anus (arrow); B, Bleeding from gills and enlarged spleen (arrow); C, Bleeding from enlarged liver and pyloric pendant (arrow).图2 分离菌回归感染大口黑鲈病症图Fig.2 Separated bacteria return to infect largemouth black bass disease diagram

2.3 AV040株的形态观察及生理生化特征

AV040株在LB平板上形成圆形、表面光滑、边缘整齐、半透明状凸起的灰白色菌落(图3-A),在血平板上可见透明β-溶血圈(图3-B),其为两端钝圆的革兰氏阴性杆菌(图3-C)。

A,菌株形态;B,溶血圈;C,革兰氏染色。A, MH isolation culture; B, Hemolytic ring; C, Microscopic observation of Gram staining.图3 菌落形态Fig.3 Colony morphology

根据菌株菌体形态和其理化特征(表1),初步判定AV040株为维氏气单胞菌温和型。

表1 病原菌的生化反应

2.4 AV040系统发育进化树构建

AV040 16S rDNA序列(1 430 bp, GenBank ID: OL441605.1)与维氏气单胞菌(GenBank ID: CP034967)同源性最高,为99.93%。系统发育进化树(图4)中,AV040与维氏气单胞菌(HY6株)聚为一支。结合16S rDNA鉴定结果和生理生化特性,判定AV040株为温和型维氏气单胞菌。

图4 AV040株系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of the AV040 strain

2.5 AV040基因组概况

维氏气单胞菌AV040基因组大小为4 501 581 bp (GenBank ID: CP095841),序列GC含量为58.77%,编码基因3 955个,包含分泌蛋白编码基因434个、TMHMM蛋白编码基因3 955个、T3SS效应蛋白编码基因440个。AV040染色体的基因圈图如图5所示。

2.6 基因功能注释分析

AV040全基因组序列在碳水化合物活性酶数据库中(Carbohydrate-Active Enzymes Database)共注释基因92个,在病原体宿主相互作用数据库(Pathogen Host Interactions)中共注释基因859个,在同源基因族数据库(Database of Clusters of Orthologous Genes)中共注释基因3 720个,在基因本体数据库(Gene Ontology)中共注释基因2 867个,在京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)中共注释基因2 164个,在非冗余蛋白库(Non-Redundant Protein Sequence Database)中共注释基因3 939个。

2.7 COG和KEGG聚类分析

AV040基因组中具有生物学功能的蛋白质编码基因按COG分类标准可划分为22类,共注释蛋白编码基因3 720个(图6)。参与基础功能的基因441个,占11.85%;参与氨基酸代谢及转运的基因370个,占9.95%;参与信号转导的基因287个,占7.72%;转录相关基因276个,占7.42%;参与能量产生和转换的基因235个,占6.32%;参与碳水化合物的运输和代谢的基因213个,占5.73%。此外,7.90%的基因在COG中未归类,功能尚不明确。

1,RNA加工与修饰; 2,染色质结构和动态变化; 3,能量产生和转换; 4,细胞周期控制、细胞分裂、染色体分化; 5,氨基酸的转运和代谢; 6,核苷酸的运输和代谢; 7,碳水化合物的运输和代谢; 8,辅酶的运输和代谢; 9,脂质的运输和代谢; 10,翻译、核糖体结构和生物生成; 11,转录; 12,复制、重组和修复; 13,细胞壁、细胞膜、包膜的生物生成; 14,细胞运动; 15,翻译后修饰、蛋白质周转、伴侣蛋白; 16,无机离子运输和代谢; 17,次生代谢物的生物合成、运输和分解; 18,一般功能; 19,功能未知; 20,信号转导; 21,胞内分泌和囊泡运输; 22,防御机制。1, RNA processing and modification; 2, Chromatin structure and dynamics; 3, Energy production and conversion; 4, Cell cycle control, cell division, chromosome differentiation; 5, Amino acid transport and metabolism; 6, Nucleotide transport and metabolism; 7, Carbohydrate transport and metabolism; 8, Coenzyme transport and metabolism; 9, Lipid transport and metabolism; 10, Translation, ribosome structure and biogenesis; 11, Transcription; 12, Replication, recombination and repair; 13, Cell wall, membrane and envelope biogenesis; 14, Cell motility; 15, Post-translational modifications, protein turnover, chaperone proteins; 16, Inorganic ion transport and metabolism; 17, Secondary metabolite biosynthesis, transport and catabolism; 18, General function; 19, Function unknown; 20, Signal transduction; 21, Intracellular secretion and vesicular transport; 22, Defense mechanisms.图6 AV040 COG功能分类Fig.6 AV040 COG functional classification

AV040基因组在KEGG中共注释代谢通路41条,基因2 164个(图7)。富集到代谢通路相关基因有6大类,即机体系统、代谢、人类疾病、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程。AV040基因组中参与代谢途径的基因最多,共1 120个;与人类疾病相关基因139个。

1,消化系统;2,免疫系统;3,神经系统;4,循环系统;5,内分泌系统;6,环境适应;7,老化;8,发育和再生;9,排泄系统;10,核苷酸代谢;11,脂质代谢;12,其他氨基酸的代谢;13,糖类的生物合成和代谢;14,其他次级代谢物的生物合成;15,外来生物的生物降解和代谢;16,萜类和聚酮类的代谢;17,碳水化合物的代谢;18,氨基酸的代谢;19,辅因子和维生素的代谢;20,能量代谢;21,内分泌和新陈代谢疾病;22,心血管疾病;23,癌症:特定类型;24,耐药性:抗生素;25,感染性疾病:寄生虫病;26,传染性疾病:细菌性;27,免疫性疾病;28,传染性疾病:病毒性;29,癌症:概况;30,神经退行性疾病;31,耐药性:抗肿瘤;32,翻译;33,折叠、分类和降解;34,复制和修复;35,转录;36,膜运输;37,信号转导;38,细胞运动;39,细胞生长和死亡;40,细胞群落-原核生物;41,运输和分解代谢。1, Digestive system; 2, Immune system; 3, Nervous system; 4, Circulatory system; 5, Endocrine system; 6, Environmental adaptation; 7, Aging; 8, Development and regeneration; 9, Excretory system; 10, Nucleotide metabolism; 11, Lipid metabolism; 12, Metabolism of other amino acids; 13, Biosynthesis and metabolism of sugars; 14, Biosynthesis of other secondary metabolites; 15, Foreign biodegradation and metabolism of organisms; 16, Metabolism of terpenoids and polyketides; 17, Metabolism of carbohydrates; 18, Metabolism of amino acids; 19, Metabolism of cofactors and vitamins; 20, Energy metabolism; 21, Endocrine and metabolic diseases; 22, Cardiovascular diseases; 23, Cancer: specific types; 24, Drug resistance: antibiotics; 25, Infectious diseases: parasitic disease; 26, Infectious diseases: bacterial disease; 27, Immune diseases; 28, Infectious diseases: viral disease; 29, Cancer: profile; 30, Neurodegenerative diseases; 31, Drug resistance: antitumor; 32, Translation; 33, Folding, sorting and degradation; 34, Replication and repair; 35, Transcription; 36, Membrane transport; 37, Signal transduction; 38, Cell motility; 39, Cell growth and death; 40, Cell communities-prokaryotes; 41, Transport and catabolism.图7 AV040 KEGG通路注释Fig.7 AV040 KEGG pathway annotation

2.8 致病力与毒力基因分析

腹腔注射AV040株对昆明(KM)小鼠的LD50为2.97×107CFU·g-1。攻毒后小鼠蜷缩、眯眼、颤抖,肝脏、肠道出血(图8)。

图8 AV040菌株感染小鼠解剖图Fig.8 Anatomical diagram of AV040 strain infected mice

腹腔注射AV040株对大口黑鲈的LD50为6.53×106CFU·g-1。攻毒后临死鱼病症与回归感染结果一致。AV040攻毒浓度大于108CFU·g-1时,大口黑鲈全部死亡,累计死亡曲线如图9。

图9 AV040感染大口黑鲈累计死亡量Fig.9 Accumulated deaths of AV040 infected largemouth bass

AV040全基因组中有253个编码序列可能为毒力基因。其中黏附分子156个,包括Ⅳ型鞭毛Flp(Flp type Ⅳ pili)基因(flp1、flpA-L)、Ⅳ型鞭毛Tap(Tap type Ⅳ pili)基因(tapA-D、tapF、tapM-Q、tapT-W、tapY1-2、tppA-F)、侧向鞭毛(lateral flagella)基因(flgC、flgE、flgI、flgJ、fliF、fliJ、fliP)、I型鞭毛(Type I fimbriae)基因(flimA、flimC-F)、甘露糖敏感的血凝素Ⅳ型鞭毛(mannose-sensitive haemagglutinin type Ⅳ pili)基因(mshA-Q)和极性鞭毛(polar flagella)基因(cheA-2、cheB-2、cheR-3、cheV-Z);分泌系统85个,包括T2SS分泌系统基因(exeA-N)、T3SS分泌系统基因(acr1-2、acrH、acrR、acrV、aexT、ascB-Y)、T6SS分泌系统基因(astA-S、clpV1、dotU、vgrG1-3、hcp1);毒素12个,包括溶血素Ⅲ(hemolysin Ⅲ)、溶血素HlyA(hemolysin HlyA)基因(hlyA)、溶血素外排AHH1(extracellular hemolysin AHH1)基因(ahh1)、耐热溶血素(hemolysin)基因(ast)和毒素重复序列(repetitive sequence, RTX)基因(rtxA-H)。

2.9 耐药性与耐药基因分析

AV040全基因组含有耐药基因5个,K-B药敏试验验证表型。其中OXA-912和cphA3与碳青霉烯类(carbapenems)的耐药性有关,对碳青霉烯类(carbapenems)的亚胺培南耐药;rsmA和adeF与氨基糖苷类(aminoglycosides)、氨基香豆素类(aminocoumarins)、喹诺酮类(quinolones)和四环素类的耐药性有关,对氨基糖苷类的庆大霉素、卡那霉素、新霉素和丁胺卡那,喹诺酮类的诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星和氧氟沙星,四环素类的多西环素和四环素敏感和中介;EF-Tu突变体与利福霉素类(rifamycin)的耐药性有关,对利福霉素类的利福平耐药。

AV040株基因组中未检测出耐药基因,但耐药的抗生素,包括林可酰胺类的克林霉素和林可霉素、硝基咪唑类的甲硝唑、甲氧苄啶类的甲氧苄啶、青霉素类的青霉素G和氨苄西林。

AV040株基因组中未检测出耐药基因,表型敏感或中介的抗生素,包括肽类的万古霉素、多黏菌素B,大环内酯类的红霉素、阿奇霉素和克拉霉素,磷霉素类的磷霉素,头孢菌素类的头孢氨苄和头孢噻肟,复方磺胺类的复方新诺明,酰胺醇类的氯霉素和氟苯尼考(表2)。

表2 耐药基因和药敏抑菌圈

3 讨论

3.1 致病力与毒力基因分析

比较大口黑鲈源不同维氏气单胞菌菌株对大口黑鲈的LD50发现,LD50从大到小依次为:AV040株(6.53×106CFU·g-1)、未命名菌株(2.6×106CFU·g-1)[12]、未命名菌株(0.2×106CFU·g-1)[1]、未命名菌株(7.94 ×105CFU·g-1)[13]、HN1903株(3.72×104CFU·g-1)[10]、GJL1株(7.2×103CFU·g-1)[5]。可见本次分离的维氏气单胞菌AV040株对大口黑鲈的毒力低于以上已报道的大口黑鲈源维氏气单胞菌菌株。

比较不同宿主来源的维氏气单胞菌对小鼠的LD50发现,LD50从大到小依次为:大口黑鲈源(AV040株,2.97×107CFU·g-1)、鸭源(未命名菌株,5.0×106.5CFU·g-1)[14]、人源(RY001株,1.4×106CFU·g-1)[15]、黄颡鱼源[TH0426株,(7.47±2.30)×105CFU·g-1][16]。可见本次分离的维氏气单胞菌AV040株对公共卫生的威胁低于已报道的维氏气单胞菌菌株。

致病性维氏气单胞菌属于条件致病菌,由特定菌毛抗原和毒素等引起宿主感染[17]。AV040基因组中发现Ⅳ型鞭毛、侧向鞭毛、I型鞭毛、甘露糖敏感的血凝素Ⅳ型鞭毛、极性鞭毛相关基因,这些基因编码产物在细菌与宿主细胞黏附中起到重要作用[18]。

AV040通过分泌系统分泌毒力因子(如毒素和水解酶)对宿主产生致病性[19]。T2SS分泌系统输出水解酶和溶血素[20]。T3SS形成纤毛状的通道连通细菌和宿主的细胞膜,使毒素可直接进入宿主细胞内[21]。T6SS分泌系统输出蛋白质效应物,如G重复蛋白(VgrG)和溶血素协同调节蛋白(Hcp),作用于宿主细胞的细胞膜[22]。

AV040基因组中存在5种溶血相关毒力因子,溶血素是致病性维氏气单胞菌重要的毒力因子,可引起细胞毒性和红细胞裂解,导致宿主内出血[5,23]。RTX蛋白增强维氏气单胞菌躲避宿主免疫系统的能力,使其在宿主体内生存的时间延长[24-25]。

3.2 AV040耐药基因和药敏表型

在AV040基因组中,发现了3种耐药机制,分别是抗生素失活、抗生素外排和抗生素靶点改变。AV040基因组中,OXA(β-内酰胺酶基因)编码参与灭活头孢类抗生素的蛋白,cphA(β-内酰胺酶基因)编码参与灭活碳青霉烯类抗生素的蛋白[19]。adeF基因编码参与氟喹诺酮和四环素类抗生素耐药性的外排泵蛋白,rsmA基因编码参与氟喹诺酮和氨基糖苷类抗生素耐药性的外排泵蛋白,两者均属于RND抗生素外排泵家族。RND家族蛋白在革兰氏阴性细菌的细胞膜上创建一个蛋白通道,用于运输细胞内的抗生素至细胞外,使细菌产生抗生素耐药性[26]。

AV040对碳青霉烯类抗生素的亚胺培南、氨基香豆素类的新生霉素和利福霉素类的利福平具有耐药性,耐药表型与基因型一致。AV040未表现出对氨基糖苷类、喹诺酮类和四环素类抗生素的耐药性,但是耐药基因可能会进一步产生对应抗生素的耐药性,使头孢类、氟喹诺酮类抗生素和四环素类抗生素对AV040的最小抑菌浓度提高[27]。

综上所述,通过全基因组测序分析,初步掌握了大口黑鲈源维氏气单胞菌AV040基因组的结构、编码基因的组成和蛋白功能的预测,以及毒力因子和耐药基因等信息,并通过体外试验验证了部分毒力基因和耐药基因与表型之间的关系。本研究结果为理解大口黑鲈源维氏气单胞菌的致病性和耐药性提供了分子水平的数据支撑。