黄 薇，凌睿云，高乐欣，唐 文，钱令波，陈峰阳

杭州医学院 基础医学与法医学院，浙江 杭州 310053

CD4+Foxp3+调节性T细胞,即Treg细胞,是CD4+T细胞的免疫抑制亚群,其特征是转录因子Foxp3的表达上调。Treg细胞是维持免疫耐受和内环境稳定的正常免疫系统不可或缺的组成部分,然而,在多数肿瘤的微环境中,聚集的Treg细胞抑制抗肿瘤免疫反应,进而促进肿瘤进展[1]。因此,Treg细胞与肿瘤的免疫逃逸、耐药以及不良预后都密切相关[2]。

近年来,肿瘤的治疗手段日新月异,但化学治疗(化疗)仍是临床治疗的主要手段,而肿瘤耐药是化疗药物难以为继、无法达到预期治疗效果的主要障碍。肿瘤化疗药物引起耐药的原因多样,期中一个重要原因是肿瘤免疫微环境的改变,包括Treg细胞比例或功能的改变[3]。研究发现,有些化疗药如环磷酰胺(cyclophosphamide)和吉西他滨(gemci-tabine)能降低肿瘤微环境Treg细胞的比例[4],而博来霉素(bleomycin)则会提高Treg细胞的比例[5],但大部分化疗药物对Treg细胞的影响并不清楚。

为了更好的了解化疗药物对Treg细胞的影响,进而进一步明确化疗药物对免疫微环境的改变及耐药机制,本文选取20种临床常用的化疗药,体外观察了其对Treg细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物:SPF级雌性C57BL/6小鼠,6周龄[上海斯莱克实验动物有限责任公司,合格证号:SCXK(沪)2017-0005]。实验动物购得后饲养1周再进行实验。

1.1.2 主要试剂:重组小鼠IL-2、FITC-抗小鼠-TCRβ和PerCP-Cy5.5抗小鼠-CD4(BD Pharmingen 公司);APC抗小鼠-Foxp3及其同型(isotype)对照、Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set和CellTraceTMViolet (Thermo Fisher Scientifc公司);20种化疗药标准品(上海阿拉丁试剂有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾Treg细胞的分离:无菌取小鼠脾脏,制成单细胞悬液,细胞筛过滤及PBS洗涤后以含1%青霉素和链霉素及10% FBS的1640培养液混悬。

1.2.2 Treg细胞增殖的测定:取小鼠脾细胞,先用CellTraceTMViolet 标记,后调整浓度为1×1010个/L。于96孔细胞培养板中,每孔加入细胞悬液100 μL,再加入重组小鼠IL-2及化疗药物各50 μL。IL-2的浓度为250 ng/L,化疗药物的浓度根据先前对脾细胞的毒性测定结果而定,采用无细胞毒性的最大浓度。3组细胞分别是control组(1640培养液); IL-2组(250 ng/L IL-2);化疗药物组(IL-2+化疗药)。培养3 d后,收集细胞,采用Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set破膜和固定,以荧光抗体FITC-TCRβ、PerCP-Cy5.5-CD4和APC-Foxp3标记后,流式细胞仪测定Foxp3+CD4+T细胞比例及CellTrace标记的增殖细胞比例。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 吉西他滨明显抑制IL-2诱导的Treg细胞的增殖

与对照组相比,IL-2刺激后,CD4+T细胞中Foxp3+Treg细胞的比例明显增加(P<0.05);进入细胞分裂周期的Treg细胞数也从正常组的约16%提高到约42%(P<0.05)。加入吉西他滨后,细胞分裂周期的Treg细胞数显著降低(图1)。

图1 FACS测定Treg细胞比例和增殖Fig 1 Proportion and proliferation of Treg cells were assayed by FACS

2.2 20种化疗药对IL-2诱导的Treg细胞增殖的影响

按照上述方法,共检测20个化疗药在无细胞毒性浓度下的作用。有12个能显著抑制IL-2诱导的Foxp3+Treg细胞增殖 (P<0.05),表现为Foxp3+Treg细胞比例的减少和分裂细胞数的降低(表1)。

表1 20种化疗药对IL-2诱导的Treg细胞增殖的影响Table 1 Effects of 20 chemotherapeutic agents on the proliferation of Treg cells induced by n=3)

3 讨论

在肿瘤组织中,Treg细胞可以通过抢夺效应T细胞所需的IL-2,高表达CTLA-4分子干扰抗原递呈细胞,分泌免疫抑制性细胞因子而抑制或杀伤其他抗肿瘤免疫细胞。因此,降低肿瘤微环境中Treg细胞的数目或抑制其功能近年来被认为是抗肿瘤免疫治疗的新途径[6]。吉西他滨(gemcitabine)能减少胰腺癌患者的外周血中Treg细胞的比例[7]。多西他赛(docetaxel)或紫杉醇(paclitaxel)治疗非小细胞肺癌后,患者外周血中Treg细胞的比例也显著降低[8-9]。表柔比星(epirubicin)能抑制小鼠Treg细胞的免疫抑制功能从而促进效应T细胞的功能[10]。与这些报道相似,本结果同样显示吉西他滨、多西他赛、紫杉醇和表柔比星能直接抑制IL-2诱导的Treg细胞增殖。奥沙利铂(oxaliplatin)在结肠癌中能促进Treg细胞的增殖引起耐药[11],而本研究同样发现其对Treg细胞增殖的抑制作用。由于实验条件及体内外实验的差异, 奥沙利铂对Treg细胞的确切影响还需要更多的证据。大部分化疗药对Treg细胞的影响迄今未见报道,本研究发现,阿糖胞苷(cytarabine)、长春地辛(vindesine)、伊立替康(irinotecan)等另外7个化疗药对Treg细胞的增殖具有明显的抑制作用,卡培他滨(capecitabine)、顺铂(cisplatin)、培美曲赛(pemetrexed)等8个药物则没有明显的影响。虽然化疗药调节Treg细胞的作用已有一些报道,但其作用机制并不清楚。本研究中,影响微管蛋白的3个药物, 干扰转录和RNA合成的3个药物及2个拓扑异构酶抑制剂均能抑制Treg细胞增殖;而7个抑制核酸合成药物及4个铂类药物的结果并不一致。化疗药除了熟知的抗肿瘤靶点外,通常也会脱靶产生其他生物效应。Treg细胞表面表达有丰富的IL-2受体CD25,因此在IL-2作用下活化增殖,其机制主要与STAT5、Ras-Raf-MAPK和PI3K信号通路有关[12]。上述12种有效化疗药可能通过这3种途径发挥抑制Treg增殖的作用。当然,本实验只是体外细胞水平的观察,其结果有待体内实验尤其是临床肿瘤患者的观察和验证。

总之,通过对20种临床常用的化疗药作用于Treg细胞的观察,本研究发现有12种药物能显著抑制Treg细胞的增殖。表明除了常规作用机制外,这12种化疗药也可能通过抑制肿瘤微环境中Treg细胞的增殖而进一步发挥抗肿瘤效果。该结果对进一步阐明这些化疗药物的药理作用机制及耐药机制提供了一定的实验依据。