饲用枯草芽孢杆菌抑菌性能的研究进展

2023-10-10袁丽红柳成东肖明霞PHOUTHAPANEVanhnaseng安清聪程志斌

饲料工业 2023年18期

■ 袁丽红柳成东肖明霞 PHOUTHAPANE Vanhnaseng 安清聪程志斌*

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201；2.福建傲农生物科技集团股份有限公司，福建漳州 363000；3.老挝农林部畜牧与水产局，老挝万象 6644）

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是全球及我国畜牧业应用最广的饲用益生菌[1-3]，其改善畜禽生产性能的机制主要与菌株的抑菌性能及其调控肠道菌群的作用有关[4-7]。然而，本课题组汇总国内外大量枯草芽孢杆菌抑菌试验和动物试验的报道发现，饲用枯草芽孢杆菌的菌株繁多，菌株抑菌性能的评估客观存在“评估方法繁杂、抑菌标准不统一、研究系统性不足”等问题，致使动物饲养试验表现的生产性能产生差异化结果。鉴于此，文章提出了枯草芽孢杆菌体外抑菌性能评估研究的方向，以保障饲用枯草芽孢杆菌应用于养殖业的作用效果及其稳定性。

1 枯草芽孢杆菌抑菌性能的评估方法及标准

与大多数饲用益生菌相似，枯草芽孢杆菌抑菌性能的研究主要包括体外抑菌试验评估（in vitrobacteriostatic evaluation）和体内抑菌试验评估（in vivobacteriostatic evaluation）两方面[8]。

1.1 体外抑菌试验

已用于枯草芽孢杆菌体外抑菌实验的评估方法主要包括：琼脂扩散法（包括牛津杯法、打孔法、滤纸片法等）、最小抑菌浓度法、平板划线法和混培法等[9-11]。其中，牛津杯法具备可定量、操作方便的优势[9]，因此采用该法的研究文献最多。

汇总以往牛津杯法评估枯草芽孢杆菌抑菌性能的试验文献，发现以下问题：其一，体外抑菌研究的系统性不足。大量已报道的研究集中在枯草芽孢杆菌对动物肠道有害菌及饲料源有害菌的抑制作用，对肠道有益菌可能的抑制作用及对其他商业饲用益生菌的可能拮抗效应基本没有报道，这显然不利于评估单一或复合枯草芽孢杆菌制剂在养殖生产中的应用效果；其二：体外抑菌作用的判定标准尚未统一。牛津杯法以抑菌圈直径值(diameter of inhibition zone, DIZ)来判断抑制作用的强弱，但迄今为止DIZ 判定标准尚未统一。韩旭凯［12］采用的抑菌判定标准包括3个DIZ区间值：“高敏感”（DIZ＞20 mm）、“敏感”（8 mm＜DIZ≤20 mm）和“不敏感”（DIZ=7.80 mm）。Liang 等[13]采用的抑菌判定标准包括5 个DIZ 区间值：“极敏感”（DIZ＞20 mm）、“高敏感”（15 mm＜DIZ≤20 mm）、“中敏感”（10 mm＜DIZ≤15 mm）、“低敏感”（7.80 mm＜DIZ≤10 mm）和“不敏感”（DIZ=7.80 mm）。显然，就表1 汇总的牛津杯抑菌数据，Liang等[13]抑菌判定标准更加细致。因此，文章综述后续描述采纳Liang等[13]的标准。

表1 枯草芽孢杆菌体外抑菌作用[牛津杯法，抑菌圈直径DIZ(mm)]

1.2 体内抑菌试验

体内抑菌试验一般通过检测饲喂枯草芽孢杆菌制剂的畜禽肠道食糜或粪便中特定细菌的数量（包括肠道有害菌、肠道有益菌），来评估饲用枯草芽孢杆菌对肠菌群的调控效果。肠道特定细菌数量(或相对数量)的检测方法，主要包括宏基因组测序法[1]、实时荧光定量PCR法[3]、平板计数法等[14-15]。

1.2.1 宏基因组测序法

宏基因组测序法的优点是能从细菌分类学角度，详细地分析饲喂枯草芽孢杆菌对畜禽肠道菌群“门纲目科属种”的影响，且当前检测仪先进，因此分析工作效率极高。然而，该方法的最大缺点是只能给出菌群丰度值，无法定量某一特定肠道菌的数量级。例如：在产气荚膜梭菌攻毒动物模型条件下，宏基因组测序法只能分析肠道中梭菌属细菌的相对丰度，无法定量攻毒产气荚膜梭菌的数量级及变化[1]。

1.2.2 实时荧光定量PCR法

相对宏基因组测序法难以定量肠道特定菌的数量级，实时荧光定量PCR法的优点是可高效检测肠道特定菌的数量级[3]。然而，实时荧光定量PCR 法的明显缺点是无法进一步分析肠道总厌氧菌、总需氧菌的数量级及其之间的比例，而肠道总厌氧菌及总需氧菌数量是表征肠道菌群平衡的重要指标之一。

1.2.3 平板计数法

平板计数法最大的优点是操作简单、结果直观，且能满足对表征畜禽肠道菌群平衡状态的总菌数、总厌氧菌、总需氧菌以及某些特定肠道细菌(大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌等肠道有害菌；乳酸杆菌、双歧杆菌等肠道有益菌)的数量级进行平板计数定量[14-15]。诚然，定量计数均需特定的培养基及培养条件，因此平板计数法的缺点是分析工作效率低。

综上分析，基于可定量的报道数据，表1 汇总了体外抑菌试验评估枯草芽孢杆菌的抑菌作用(牛津杯法)，表2汇总了体内抑菌试验评估饲用枯草芽孢杆菌对畜禽肠道菌群的调控作用(平板计数法)。文章重点阐述枯草芽孢杆菌体外抑菌作用评估，并与肠菌群调控结果相互印证。

表2 饲用枯草芽孢杆菌对畜禽肠道菌群的调控作用(菌数检测为平板计数法)

2 枯草芽孢杆菌对畜禽肠道有害菌的抑菌作用

大部分研究发现，枯草芽孢杆菌对大肠杆菌、沙门氏菌、梭菌等属的致病菌的作用机制主要包括以下几个方面：①生物夺氧学说：枯草芽孢杆菌在繁殖过程中均可消耗肠道内的氧气，造成局部厌氧环境，促进厌氧菌的繁殖和生长；②菌群屏障学说：枯草芽孢杆菌在消化道生成致密的膜菌群，枯草芽孢杆菌能与致病菌争夺生存空间、定居位点、繁殖空间以及营养物质，从而抑制病原菌的生长与繁殖；③抗菌物质：枯草芽抱杆菌能够产生枯草菌素和枯草杆菌素等两种小分子细菌素；枯草芽孢杆菌分泌几丁质酶作用于真菌细胞壁，β-葡聚糖酶因其能水解β（1→3）糖苷键所以具抗真菌作用。它们可以通过完全降解病原菌细胞壁来抑制病原菌生长；枯草芽孢杆菌还可以产生的抗菌多肽，从而对致病菌产生抑制作用[1，3，12]。

2.1 枯草芽孢杆菌对大肠杆菌的抑菌作用

表1 汇总了18 篇枯草芽孢杆菌对大肠杆菌体外抑菌的DIZ 数据，并参考Liang 等[13]的抑菌判定标准，分析如下：①极敏感：18 篇文献中的3 篇文献[16-18]，包括谢晓佩等[16]发现三株枯草芽孢杆菌(KC5、KC6、KC7)、王琦等[17]报道的3 个菌株(Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7)、庄国宏等[18]显示菌株GD，均对大肠杆菌的DIZ 达到20 mm 以上，有极强的抑制作用；②高敏感：6 篇文献显示[16-21]，枯草芽孢杆菌对大肠杆菌DIZ 范围为15～20 mm，有良好的抑制作用；③中敏感：8篇文献显示[19，22-28]，枯草芽孢杆菌对大肠杆菌DIZ 范围为10～15 mm，有一定的抑制作用；④低敏感：Liang 等[13]和辛娜等[28]报道2 株枯草芽孢杆菌对大肠杆菌DIZ范围为7.8～10 mm，抑制作用偏弱；⑤不敏感：5 篇文献显示[28-32]，多株枯草芽孢杆菌对大肠杆菌DIZ 为7.8 mm，无抑制作用。以上结果提示，不同菌株的枯草芽孢杆菌对大肠杆菌的抑制作用有显著差异。

表2 汇总了多篇饲用枯草芽孢杆菌对鸡、猪肠道食糜或粪便大肠杆菌数量（平板计数法）影响的动物试验结果。其一：肉鸡饲养试验。齐博等[34]在鸡饲粮中添加较低剂量枯草芽孢杆菌（105CFU/g）发现，与对照组（基础饲粮组，BD）相比，试验组（枯草芽孢杆菌组，PD）肉鸡21 日龄和42 日龄的盲肠食糜大肠杆菌数量未显著降低。袁文菊等[37]和Jeong 等[15]研究显示，与对照组相比，试验组添加中剂量（106CFU/g）、高剂量（107CFU/g）枯草芽孢杆菌显著降低了盲肠大肠杆菌数量、未降低回肠大肠杆菌数量。此外，更多试验显示[14，35-36]，饲用枯草芽孢杆菌同时显著降低了盲肠和回肠的大肠杆菌数量。其二，猪饲养试验。杨阳等[38]在饲粮中添加枯草芽孢杆菌发现，与对照组相比，试验组猪盲肠和结肠食糜大肠杆菌数量显著降低，但对回肠食糜大肠杆菌无显著影响。Guo等[41]报道，饲用枯草芽孢杆菌显著降低猪粪便大肠杆菌数量。然而，更多的猪饲养试验表明，饲用枯草芽孢杆菌对肠道食糜及粪便大肠杆菌数量无显著影响[42-44]。

以上分析提示，除试验动物种类、枯草芽孢杆菌添加量、取样部位等因素，菌株抑菌作用的巨大差异可能是影响肠道大肠杆菌调控效果的关键，这显然会对动物的生产性能产生重要影响。

2.2 枯草芽孢杆菌对沙门氏菌的抑菌作用

表1汇总了8篇枯草芽孢杆菌对沙门氏菌体外抑菌的DIZ 数据，参考Liang 等[13]的抑菌判定标准，分析如下：①高敏感：8篇文献中的4篇文献[18-20，22]，包括李善仁等[20]报道的两株枯草芽孢杆菌CS16 和CS21、卢冰霞等[22]发现的菌株Y1、陈亮等[19]研究的菌株B332、庄国宏等[18]报道的菌株GD，均对沙门氏菌属致病菌有良好的抑制作用；②中敏感：3 篇文献显示[18，20，24]，枯草芽孢杆菌对沙门氏菌有一定的抑制作用；③不敏感：2 篇文献显示[29，32]，多株枯草芽孢杆菌对沙门氏菌无抑制作用。以上数据表明，不同菌株的枯草芽孢杆菌对沙门氏菌的抑制作用有显著差异。

大量的肉鸡饲养试验显示（表2），饲粮中添加106～107CFU/g 枯草芽孢杆菌显著降低了肉鸡肠道食糜中沙门氏菌的总菌数[14-15，35]。然而，邢帅兵等[40]在仔猪上的试验却显示，枯草芽孢杆菌对肠道食糜沙门氏菌数量无显著影响。尽管仔猪试验很少测定肠道沙门氏菌，但这一结果似乎提示，饲用枯草芽孢杆菌对沙门氏菌的抑制作用在家禽肠道比生猪肠道的效果更突出。诚然，这一推测有待于进一步验证。

2.3 枯草芽孢杆菌对产气荚膜梭菌的抑菌作用

包括产气荚膜梭菌在内的多种致病梭菌诱发动物坏死性肠炎，其发病率较大肠杆菌、沙门氏菌低，且隐性病症不易发觉，易被养殖管理者忽视[44-45]。表1汇总了3 篇枯草芽孢杆菌抑制产气荚膜梭菌的体外牛津杯试验文献。阳艳林等[33]研究了7株枯草芽孢杆菌，结果显示枯草芽孢杆菌PB6(克洛生)对产气荚膜梭菌抑制作用达极敏感，另外2 株为高敏感、1 株为中敏感、3 株为不敏感。辛娜等[28]评估了6 株枯草芽孢杆菌，结果显示2株为中敏感、1株为低敏感、3株为不敏感。魏可健等[31]证明枯草芽孢杆菌C3 对产气荚膜梭菌无抑制作用。

上述研究表明，大部分枯草芽孢杆菌无法高效抑制产气荚膜梭菌，这得到了体内试验的印证(表2)。袁文菊等[37]在肉鸡饲粮中添加3.0×106CFU/g 枯草芽孢杆菌，发现可显著降低盲肠食糜梭菌数量、但无法降低回肠食糜梭菌数量；而且，他们的另一试验组枯草芽孢杆菌添加量略微降至1.5×106CFU/g，则同时无法降低盲肠和回肠的梭菌数量。Jeong 等[15]在饲粮中添加更高剂量（3.0×107CFU/g）枯草芽孢杆菌，无法降低肉鸡盲肠和回肠的梭菌数量。

3 枯草芽孢杆菌对饲料源有害菌的抑菌作用

金黄色葡萄球菌是饲料源主要致病细菌之一[44]，枯草芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌抑制研究较多，14篇报道的DIZ数据显示（表1）：①极敏感：14篇文献中的5 篇文献[16-18，20，29]，包括谢晓佩等[16]发现3 株枯草芽孢杆菌（KC5、KC6、KC7）、王琦等[17]报道的3 个菌株（Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7）、庄国宏等[18]研究的4 个菌株（GD、WT、POC-4、SF-1）、齐鹏飞等[29]显示的菌株LV-1 和LV-2、李善仁等[20]研究的3 个菌株（CS16、CS21、CS27），均对金黄色葡萄球菌有极强抑制作用；②高敏感：3 篇文献显示[16-17，21]，枯草芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌有良好的抑制作用；③中敏感：8 篇文献显示[22-27，30，32]，枯草芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用；④低敏感：仅有1 篇文献显示[29]，枯草芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌抑制作用偏弱。

以上数据提示，不同菌株的枯草芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌的抑菌作用有显著差异。由于广谱抗生素能够显著抑制金黄色葡萄球菌[44-45]，以往饲用抗生素的应用掩盖了饲料源金黄色葡萄球菌感染肠道的风险，但当前“禁抗”形式下须重新审视及解决这一问题。例如，通过体外抑菌试验筛选强效抑制金黄色葡萄球菌的枯草芽孢杆菌菌株，并应用于养殖生产。

4 枯草芽孢杆菌对畜禽肠道有益菌的抑制作用

众所周知，广谱饲用抗生素抑制乳酸杆菌和双歧杆菌等肠道有益菌，破坏畜禽肠菌群平衡[44，47]。然而，包括枯草芽孢杆菌在内的饲用益生菌对肠道有益菌的体外抑制作用却鲜有报道[44-47]。李先磊等[11]采用体外混培试验显示，枯草芽孢杆菌HnB-4对乳酸杆菌HnL-3无抑制作用。相反，李在建等[48]的体外混培试验表明枯草芽孢杆菌对乳酸杆菌(菌株编号CICC6075)有显著的抑制作用。以上不同的结果提示，枯草芽孢杆菌对肠道有益菌可能的抑制作用需重新认识。

表2 肉鸡饲养试验显示，饲用枯草芽孢杆菌显著增加肉鸡肠道食糜乳酸杆菌数量，但对双歧杆菌无明显影响。猪饲养试验显示，饲用枯草芽孢杆菌显著增加盲肠和结肠食糜乳酸杆菌数量[38，40]；相反，也有文献报道饲用枯草芽孢杆菌未显著增加肠道及粪便的乳酸杆菌数量[42，44]；此外，枯草芽孢杆菌对猪肠道食糜及粪便的双歧杆菌无明显影响[42]。结合上述体外抑菌试验报道，肠道菌群差异化的表现提示，饲用枯草芽孢杆菌对畜禽肠道有益菌的影响需进一步明晰。

5 枯草芽孢杆菌对商业饲用益生菌的抑菌作用

当前，我国《饲料添加剂品种目录(2013)》中应用较为广泛的饲用益生菌包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌、丁酸梭菌、粪肠球菌、屎肠球菌、凝结芽孢杆菌等7 种[46]。饲料禁抗形势下，由于畜禽养殖问题和需求的多样性，基于不同益生菌差异化的益生性能，催生了复合饲用益生菌制剂的普遍使用。然而，课题组前期综述及多个体外抑菌试验均表明，益生菌之间存在拮抗效应[43，46，49]。

枯草芽孢杆菌对其他商业益生菌抑制作用的研究极少（表1），仅有的一篇报道显示4 株枯草芽孢杆菌（菌株编号：SF-1、WT、POC-4、GD）对酵母菌均有极强的抑制作用，且抑制效果有明显差异[18]。这一体外试验结果得到了李玲茜等[6]动物试验的印证。李玲茜等[6]通过鸡饲养试验发现，与单一枯草芽孢杆菌组相比，组合应用枯草芽孢杆菌和酵母菌组肉鸡的增重、采食量及料重比均无明显改善。此外，课题组前期体外抑菌试验[43，46，49]、动物试验[4-5]均表明，枯草芽孢杆菌与凝结芽孢杆菌、丁酸梭菌之间均存在拮抗效应。