胡谦，李欣奕，袁野，韩旭，齐晓松，李嘉琦，郭艳莉，马晓虎，刘伟

陕西师范大学化学化工学院，陕西省生命分析化学重点实验室，西安 710119

1 引言

近年来，中级分析化学实验已经在国内的一些院校开设[1]，我校也给本科生开设了中级分析化学实验的选修课。由于中级分析化学实验在大学三年级开设，学生已经学习了化学的四大基本学科，也具备了基本的实验操作技巧，因此中级分析化学实验的开展可以促进本科生化学综合知识的应用，同时也能够培养学生交叉融合的实验能力。因此，本着这样的理念，我们设计了一些与生活实践相关的中级分析化学实验，使同学们在融会贯通各门知识的基础上，能够真正具备解决问题的能力，从而培养学生的创新能力[2]。

本实验利用化学发光检测，设计了一种可以测定微量过氧化氢(H2O2)的纸分析芯片。H2O2是一种强氧化剂，其水溶液就是俗称的双氧水[3]。在日常生活中，H2O2的使用十分广泛，其水溶液适用于医用伤口消毒及环境和食品消毒。但H2O2同时具有一定的环境和健康危害，过量的H2O2会伤害人体的中枢神经。同时在生物代谢过程中，H2O2也是一种重要的信号物质[4]，体内过多的H2O2会导致氧化应激，因此测定微量的H2O2具有一定的研究意义。目前见到的微量H2O2的光学分析方法中，比色[5]、荧光[6]及化学发光[7]的方法均得到比较普遍的应用。而在光学分析方法中，化学发光方法[7]因其无需光源、灵敏度高和线性范围宽的特点被广泛应用于H2O2的检测中。鲁米诺-H2O2[8]体系是一个最基本的化学发光体系，在该体系中，H2O2是其基本的测定物质，所有能与H2O2发生直接或间接反应的物质均可用该体系进行测定。

基于以上的研究背景，在师范类院校中开展与化学发光有关的相关实验可以促进师范类高校对于创新性人才的培养，同时也可以提高师范生的学科专业素养。因此结合本课题组在化学发光纸芯片上多年的研究，选取课题中比较前沿且研究完整的实验，以微量H2O2的测定开展中级分析化学实验。该实验中，选择具有大的比表面和化学发光催化活性的有机金属框架(MOFs)材料[9]，作为鲁米诺-H2O2体系的催化剂。利用1,3,5-均苯三甲酸(H3BTC)作为配体合成Cu-BTC，在纸芯片上结合Cu-BTC[10]对鲁米诺-H2O2化学发光[11]体系的催化作用，可实现微量过氧化氢的测定。在该中级分析化学实验的进行中，学生需要掌握有机化学的合成操作，简易纸芯片的基本制作手段和反应釜的使用操作，同时还要熟悉化学发光仪的使用。在实验开展之前，需要学生们自主进行文献检索和文献阅读，培养学生独立阅读文献的能力和探究精神。实验中遇到问题时，可以让学生自主分析问题的产生原因，使动手能力和科研思维均得到锻炼和提高，同时也可以培养师范生和非师范生的多方面能力。

2 实验目的

(1) 掌握Cu-BTC材料的合成和纸芯片的制备方法及主要应用；

(2) 了解化学发光仪的原理，掌握其基本的操作方法；

(3) 掌握鲁米诺-H2O2化学发光原理；

(4) 掌握H2O2浓度与发光强度的数学模型关系及数据处理方法。

3 实验原理

纸芯片的概念最早由Whitesides提出，就是在一定尺寸的纸片上精细加工亲、疏水通道，使分离及检测等一系列工作[12]集成在纸上进行的微流控平台。目前，纸芯片已广泛应用于各种检测方法中[13]。

近年来，MOFs的研究和应用得到了迅速发展。MOFs是由无机金属中心与桥联的有机配体通过自组装相互连接的具有周期性网络结构的多孔材料，因其具有稳定性、刚柔性、多孔性和性能的可设计性[9]，已被广泛应用于催化[14]及气体储存与分离[15]等诸多领域。

Cu-BTC作为一种新型MOFs材料，具有良好的亲水性能、多孔性和高孔容的骨架结构[10]。并且已见报道，Cu-BTC具有催化鲁米诺-H2O2化学发光的作用[11]，与传统的鲁米诺体系的催化剂辣根过氧化物酶(HRP)相比，Cu-BTC受环境影响小，使用范围广。所以本实验选择Cu-BTC作为化学发光的催化剂，将Cu-BTC负载在纸芯片之上，结合常见的鲁米诺-H2O2化学发光体系，在纸表面上完成了微量H2O2的测定。实验原理图如图1所示。

图1 纸芯片及实验原理示意图

4 试剂和仪器

4.1 反应试剂和材料

实验中所需化学试剂和材料如表1所示。

表1 实验中的试剂和材料

4.2 实验仪器

本实验使用到的小型仪器有试管、移液枪、注射器和镊子，所需的大型仪器如表2所示。

表2 实验用到的仪器

5 实验步骤

5.1 纸芯片的制备

本实验中首先需要制作实验用的纸芯片载体。如图1所示，采用纸切割机实现直径为8 mm的圆形芯片的制作。然后将白色泡沫塑料溶解于三氯甲烷中，制备粘稠的疏水试剂[16]，装于空的水彩笔内芯中，画出直径为6 mm的圆圈，这样便制得具有疏水和亲水区域的纸芯片。

5.2 Cu-BTC的制备

对于Cu-BTC的合成手段，本实验中采用文献[17]中的水热合成的方案，具体的制备方法如下：

(1) 配制配体混合溶液。称取试剂DMF (15 mL)，乙醇(15 mL)，并将DMF与乙醇按体积比1 : 1混合后，称量固体1,3,5-均苯三甲酸(H3BTC) (1.0 g，4.8 mmol)，搅拌，使固体完全溶解。

(2) 配制0.57 mol·L-1的Cu(NO3)2水溶液。称量固体Cu(NO3)2·3H2O (2.1 g，8.6 mmol)溶于15 mL H2O中。

(3) 混合溶液并反应。混合1和2中所得溶液并置于反应釜中，在100 °C下反应10 h。

(4) 离心及洗涤样品。反应结束后，将反应釜内液体与蓝色固体倒入离心管，离心。取出离心管，倒掉上清液，再加入适量DMF振摇，离心。操作重复两次。最后加入乙醇振摇，离心，再倒掉上清液。

(5) 烘干样品。将离心管置于真空烘箱内，在50 °C下烘干12 h，得到干燥的Cu-BTC固体。

5.3 鲁米诺及过氧化氢储备液的配制

1.0 × 10-2mol·L-1的鲁米诺储备液的配制：称取0.18 g鲁米诺，用0.10 mol·L-1的NaOH溶液溶解后转入100 mL棕色容量瓶中，用超纯水定容，避光保存一周后稀释使用。

实验用不同浓度的H2O2溶液由30%的H2O2溶液逐级稀释得到。实验前需要现用现配。

5.4 化学发光测定

打开MPI-B型多功能化学发光检测仪及负高压(测量高压600 V)，暗盒关闭的情况下预热30 min，使基线平稳。

将制得的Cu-BTC固体均匀分散在5.0 mL DMF试剂中，得到一定浓度的Cu-BTC催化剂溶液。向纸芯片上滴加2.5 μL新制备的2.6 mg·mL-1Cu-BTC催化剂溶液，待其干燥后置于化学发光仪暗盒中固定位置的载物台上。化学发光仪上的暗盒关闭，通过暗盒上的小孔在充分避光的情况下，连接注射泵滴加2.0 μL的2.0 × 10-3mol·L-1鲁米诺溶液于纸芯片之上；然后接着滴加2.0 μL的不同浓度的H2O2于纸芯片之上，用仪器自带的化学发光软件记录化学发光相对强度信号。

5.5 最佳鲁米诺和Cu-BTC浓度的选择

进行H2O2测定前，选择反应中最佳的鲁米诺和Cu-BTC的浓度。保证滴加体积和量不变，选择Cu-BTC的浓度时，在电子天平上称量不同量的Cu-BTC固体，分散于5.0 mL DMF中，得到浓度为0.5-3.8 mg·mL-1的溶液。2.5 μL不同浓度的Cu-BTC滴加在纸芯片之上，后滴加2.0 × 10-3mol·L-1的鲁米诺溶液和1.0 × 10-6mol·L-1H2O2，记录化学发光信号值。

进行鲁米诺最佳浓度选择时，配制0.5 × 10-3-5.0 × 10-3mol·L-1的鲁米诺溶液，固定Cu-BTC(2.6 mg·mL-1)和H2O2(1.0 × 10-6mol·L-1)浓度，按相同步骤操作，记录化学发光信号值。

5.6 线性范围和检出限

在选定的实验条件下，按照上述实验步骤，测定不同浓度(1.0 × 10-4-1.0 × 10-8mol·L-1)的H2O2溶液浓度与发光强度的关系。以H2O2溶液浓度为横坐标，以发光强度为纵坐标，绘制校准曲线。按照检出限计算公式3δblank/k(δblank为空白信号标准偏差，k为校准曲线的斜率)计算检出限。

6 结果与讨论

6.1 Cu-BTC的表征

实验初期，需要在反应釜中合成Cu-BTC。合成完毕后，对照文献[17]找中合成的Cu-BTC，为了确认Cu-BTC的成功制备，通过X射线的粉末衍射分析(XRD)衍射峰位置以及场发射扫描电子显微镜(SEM)观察其形貌，得到图2的结果。从图2A中可以看出，XRD的衍射峰出现在6.6°、9.4°和11.5°，与文献[17]中报道的衍射峰一致。图2B显示，Cu-BTC的形貌呈现的是八面体型，该晶体结构也与文献报道相符。

图2 Cu-BTC的XRD (A)及SEM (B)图

6.2 最佳鲁米诺浓度

对于鲁米诺-H2O2体系，为了提高H2O2检测的准确性与显著性，鲁米诺的浓度高低会影响测定结果，因此，首先考察鲁米诺浓度带来的影响。在2.6 mg·mL-1的Cu-BTC-DMF溶液和1.0 × 10-6mol·L-1的H2O2溶液浓度时，室温条件下，记录0.5 × 10-3-5.0 × 10-3mol·L-1的鲁米诺溶液产生的化学发光信号，结果如图3所示。结果显示，当浓度在2.0 × 10-3mol·L-1时有最佳效果，因此，选择鲁米诺溶液浓度为2.0 × 10-3mol·L-1。

图3 鲁米诺最佳浓度的选择

6.3 最佳Cu-BTC浓度

为了在最佳条件下检测H2O2，考虑其他因素可能造成的影响，Cu-BTC的浓度也需要优化。选择2.0 × 10-3mol·L-1的鲁米诺溶液和1.0 × 10-6mol·L-1的H2O2溶液浓度，在室温条件下记录0.5-3.8 mg·mL-1的Cu-BTC溶液产生的化学发光信号，得到结果如图4所示。结果显示，当浓度在2.6 mg·mL-1时拥有最佳效果，因此选择Cu-BTC溶液浓度为2.6 mg·mL-1。

图4 Cu-BTC纸上负载最佳量的选择

6.4 过氧化氢的化学发光测定

在所选定的最佳条件下，测定不同浓度H2O2的化学发光信号值，结果表明，过氧化氢浓度在1.0 × 10-4-1.0 × 10-8mol·L-1内，呈现良好的线性趋势，方程为I= 621.48lgC+ 5004 (R2= 0.9865)，I表示化学发光相对强度；C表示H2O2的浓度(mol·L-1)，如图5A所示。同时，测定了H2O2浓度在1.0 × 10-8-1.0 × 10-7mol·L-1内的校准曲线(图5B)，其线性回归方程I= 63.96C+ 44.62 (R2= 0.9970)，其中I表示化学发光相对强度；C表示H2O2的浓度，单位为10-8mol·L-1。根据IUPAC规定的检出限的计算公式，得到该方法检出限为3 × 10-9mol·L-1。因此本方法能实现微量H2O2含量的测定。

图5 不同浓度H2O2与化学发光信号图(A)及校准曲线(B)

7 实验组织及注意事项

中级分析化学实验采用小班组授课和大循环上课模式，每组设置4-6名同学，分工协作具体的实验操作和化学发光仪的使用和检测工作。实验共需要16 h，4个单元的实验时间。前2单元的实验主要是进行合成，后2单元进行相关的表征和过氧化氢的化学发光测定实验。在实验中采用大循环的小组合作模式，可以将MOFs的合成步骤与前一实验的操作同时进行，即可合并2单元的实验时间，大大提高实验时间的利用效率。同时，本实验中因需要使用反应釜，在实验过程中需将实验过程和步骤反复强化，并强调注意事项，提高学生的风险意识及加强对实验安全性的正确引导。

本中级分析化学中存在以下注意事项：

(1) 在实验过程中要注意做好个人防护，戴好口罩和手套。

(2) 在制备固体Cu-BTC的过程中，加入反应釜内的反应物不能超过釜体容积的四分之三；加热容器如烘箱的温度设置要按照操作规程严格进行；反应完成后务必使反应釜的温度降至室温时打开釜盖。

(3) 在配制溶液时，过氧化氢溶液与Cu-BTC溶液需现配现用，鲁米诺溶液的储备液(1.0 × 10-2mol·L-1)需要提前配制并避光保存一周后方可稀释使用。

(4) 在测定光信号的过程中，化学发光仪需要提前开启，待基线稳定后再进行相关数据测定。在测定光信号时，需关紧仪器盖并在实验中严格避光。

8 结语

本实验将MOFs合成于纸芯片之上，发展了一种纸上化学发光测定H2O2的中级分析化学实验，有望实现实际样品中微量H2O2含量的测定。由于中级分析化学实验在大学三年级开设，学生已经具备了无机化学、分析化学、有机化学和物理化学的基本知识和实验操作技巧，同时也具备了基本的数据统计能力，因此该实验的开设对于提高学生的综合实验能力具有一定的意义。该实验与生活实践具有一定的联系，为后续实现样品中痕量过氧化氢含量的测定提供一定的研究思路，可以拓展本科生的科研兴趣和视野，对于本科生开展后续的研究型实验和本科毕业论文具有一定的推动作用，可促进教学研究的开展和培养学生的综合及创新能力。