郑盈莹，任琦，刘桂凤，许妍

江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

中药材覆盆子的来源是蔷薇科悬钩子属植物华东覆盆子Rubus chingiiHu 的干燥未成熟果实，果实在入夏初期颜色由绿色变绿黄色时及时采收，采收时间为4～5 月，产于浙江、江西等地［1-4］，加工方式为除去梗、叶等杂质，放于沸水中短时间烫或蒸后，捞出，晒干或烘干，常见的炮制品有酒覆盆子、盐覆盆子等［5］。覆盆子具有补益肝肾的功效，即可益肾固精缩尿，又能养肝明目，临床上可治疗肝肾功能不足引起的遗精滑精、阳痿早泄、遗尿尿频、目暗昏花等症，炮制后补肾益精功效增强，可以治疗肾虚引起的遗尿尿频、阳痿遗精滑精等症；同时覆盆子还是不少经典方剂的重要药味，常见的经方有五子衍宗丸、全鹿丸、锁阳固精丸等，多数为补虚药，服药周期较长，药物的副作用和毒性易蓄积于患者体内［6］。

黄曲霉毒素（以下均用缩写AF 代替）是目前所知的毒性最强的真菌类次生毒素，具有很强的致癌性，同时具有慢性肝肾毒性。由于覆盆子药材、炮制品及制剂的服用者相当一部分肝肾功能不全，再加上服药时间较长，毒性进一步蓄积，可能对肝肾造成不可逆的损伤［7-8］。本研究通过高效液相色谱法测定覆盆子中的AF 含量，对其药材的真菌毒素污染情况进行研究，以期为覆盆子药材的安全性提供参考。

1 仪器及试药

1.1 仪器

LC-20AT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司），RF-20A 型荧光检测器（日本岛津公司），UVE 型光化学衍生化反应器（LC Tech 公司），ML204 型电子天平（Mettle Toledo 公司），T25 高速分散机（IKA公司），ST16R 型低温离心机（Thermo-Fisher 公司）。

1.2 试药

AF 混合对照品溶液（中国食品药品检定研究院，批号：610001-202006，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2标示浓度分别为1.04，0.38，1.08，0.38 μg/mL）；Afla StarTMR 免疫亲和柱（ROMER，批号:1000003007）；甲醇为色谱纯，氯化钠等其他试剂均为分析纯；超纯水为 Milli-Q Direct16 超纯水仪制备。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Capcell pak C18 柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：甲醇-水（45∶55）；流速：0.6 mL/min；衍生器：光化学衍生化反应器（λ=254 nm）；检测器：荧光检测器，检测波长：λex=360 nm，λem=450 nm。

2.2 混合对照品溶液的配制

精密吸取AF 混合对照品溶液1 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀后得到标准贮备溶液。精密量取标准贮备溶液1 mL，置20 mL 量瓶中，加甲醇定容，摇匀后即得混合对照品溶液（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2质量浓度分别为2.08、0.76、2.16、0.76 ng/mL）。混合对照品溶液色谱图见图1。

图1 AFM对照品HPLC图谱

2.3 供试品溶液的提取制备

取供试品，粉碎，取能通过二号筛的粉末约15 g，精密称定后加氯化钠粉末3 g，混匀后精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速搅拌2 min（搅拌速度20 000 r/min），离心5 min（离心速度4 000 r/min）后倾出上清液，精密量取15 mL 置50 mL 量瓶中，加水定容，摇匀后离心10 min（离心速度4 000 r/min），倾出上清液，精密量取20 mL 通过免疫亲和柱，用20 mL 水净化后抽干，最后用适量甲醇慢慢通过免疫亲和柱（时间不少于1 min），甲醇液置2 mL量瓶中并定容，摇匀后用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，续滤液即为供试品溶液。供试品溶液色谱图见图2。

图2 供试品溶液HPLC图谱

2.4 线性范围

精密吸取混合对照品溶液5，10，15，20，25 μL，分别注入液相色谱仪，测定各成分峰面积，以进样量（ng）为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），计算得到相应成分的回归方程，见表1。结果表明，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2对照品在相应的质量范围内呈良好的线性关系。

表1 线性回归方程

2.5 仪器精密度试验

取混合对照品溶液连续进样6 次，进样量均为10 μL，测定各相应成分的峰面积，结果AFB1、AFB2、AFG1、AFG2峰面积RSD 分别为0.8%，0.6%，1.0%，0.6%，表明仪器的精密度良好。

2.6 加样回收试验

取不含AF 的样品（样品批号：202101），粉碎，取样量约15 g，共9 份，分别与氯化钠粉末3 g混合后，精密加入混合对照品溶液（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2质量浓度分别为0.020 8、0.007 6、0.021 6、0.007 6 ng/mL）20、30、50 mL 各3 份，再加70%甲醇溶液补至75 mL，按“2.2”项下的供试品制备方法可得低水平、中间水平和高水平回收率的供试溶液，进样25 μL 测定，结果见表2，可见方法准确性良好。

表2 加样回收试验结果（n=9）

2.7 检出限与定量限

取不含AF 的样品粉末（样品批号：202101），精密加入一系列低浓度对照品溶液，按“2.2”项下方法制备供试溶液，分别测定，以3∶1、10∶1 的信噪比水平计算检出限、定量限，结果AFB1、AFB2、AFG1、AFG2检出限分别为0.03、0.01、0.03、0.01 μg/kg，定量限分别为0.10、0.03、0.10、0.03 μg/kg，可见方法灵敏度较高。

2.8 样品测定结果

对所收集的31 批样品中FB1、AFB2、AFG1、AFG2的含量进行测定，采用标准曲线法计算，结果均未检出。

3 讨论

此次实验共涉及31 批次样品，其中25 批次来自市售随机抽样，涵盖了成都荷花池中药材市场、河北省安国药材市场、安徽省亳州药材批发市场及樟树市中药材批发市场；6 批次来自覆盆子药材的产地收购，采收时间涵盖2019—2021 年，对于反映当前覆盆子药材的实际情况有较好的代表性。

3.1 覆盆子的安全性分析和评价

覆盆子是聚合果，每一颗果实都由许多小核果聚合而成，在采收时其中种子尚未完全成熟（见图3），其采收时间为每年四月底至五月初，主产地为我国华南至华东地区，采收、干燥期间的温湿度均十分适合黄曲霉毒素生长，故本实验专门针对覆盆子的黄曲霉毒素污染情况进行考察，结果均未检出，说明覆盆子被黄曲霉毒素污染的风险很低，可能与覆盆子中碳水化合物及油脂的含量较低有关［9］。

图3 覆盆子（整体及瘦果）

3.2 色谱条件的考察

覆盆子富含黄酮类、鞣质和有机酸［10-11］，对黄曲霉毒素的测定有一定的干扰，经过对色谱条件进行调整并最佳化［12-14］，流动相调整为甲醇-水（45∶55），流速设为0.6 mL/min 时，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2能完全分离，峰形好，样品无背景干扰。使用3 种不同品牌型号的色谱柱按此条件进行实验，结果4 种成分均分离良好，表明方法耐用性良好。由于供试品杂质多，易污染色谱柱，造成之后的测定过程中背景干扰大，建议在样品进针后以高比例有机相冲洗色谱柱，以避免出现假阳性，影响结果的准确性。