利用SLAF-seq简化基因组数据挖掘甜橙果实品质性状基因

2023-09-27李仁静申晚霞赵婉彤程莉李沛江东

中国农业科学 2023年16期

李仁静，申晚霞，赵婉彤，程莉，李沛，江东

李仁静，申晚霞，赵婉彤，程莉，李沛，江东

1西南大学柑橘研究所，重庆 400712

【目的】通过对240份不同甜橙资源群体利用SLAF-seq测序数据进行Fst与XP-CLR选择性清除分析，挖掘调控甜橙中优良性状的相关基因，为甜橙的分子育种工作提供重要参考。【方法】对国家柑橘种质资源圃（重庆）中保存的具有广泛遗传多样性和不同地理来源的240份甜橙种质资源进行SLAF-seq测序，获得全基因组范围内的单核苷酸多态性（SNP）基因型数据和单果重、果脐有无、可滴定酸含量等性状的表型数据，分析不同亚群之间Fst与XP-CLR数值。【结果】采用SLAF-seq技术对240份甜橙进行测序，共获得497.82 Mb短读数据，用BWA软件将测序数据比对到甜橙参考基因组上，取GATK和samtools两种方法得到的SNP标记交集，共得到1 467 968个SNP。利用Fst与XP-CLR分析筛选出了与甜橙果脐有无、单果重以及可滴定酸相关的候选基因。对受选择snp位点附近区域进行基因注释，结果表明基因orange1.1g044639m和orange1.1g023641m参与编码生长素外排载体，可能与脐的形成相关；orange1.1g023641m在单果重性状中的Fst得分最高，其参与编码E3泛素连接酶，可能影响果实大小和重量，orange1.1g046891m可能通过调节碳水化合物的形成来影响果实重量；orange1.1g011684m编码丙酮酸脱氢酶二氢硫辛酰胺转乙酰基酶，其cds序列发生碱基突变，可能影响了柠檬酸在不同品种间的含量；orange1.1g034502编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，基因注释功能与磷酸化/去磷酸化相关。【结论】本研究利用Fst方法对甜橙的SLAF-seq数据进行筛选。最终在甜橙资源的有无果脐、单果重和可滴定酸等性状上筛选出了6个相关的基因，可作为后期验证的候选基因，为甜橙品种的定向改良提供了依据。

SLAF-seq；Fst；XP-CLR；甜橙；单果重；可滴定酸含量；果脐有无

0 引言

【研究意义】甜橙作为目前国际市场上受欢迎程度较高的柑橘类水果，研究其重要的园艺性状遗传基础，有利于加强其种质资源的高效管理和遗传改良。对于甜橙品种来说，较重要的园艺性状有单果重量、可滴定酸含量、种子数等。甜橙中果脐的有无是脐橙品种区别于其他普通甜橙品种的一个重要园艺特征，也是普通甜橙园艺种类划分的重要依据，由于脐橙的果实品质较好，因而受到消费者和育种者的密切关注。目前，市场上较受消费者欢迎的甜橙一般来说都具有外观漂亮、高产、无核、糖酸比合适、耐贮运等特质[1]。本研究利用SLAF-seq（specific locus amplified fragment sequencing）数据挖掘甜橙果脐有无、单果重量、可滴定酸含量等园艺性状的相关基因，为这些性状的改良提供参考依据。【前人研究进展】SLAF-seq技术是一项基于限制性内切酶和高通量测序的大规模基因组测序技术[2]，其具有不受参考基因组限制，酶切方案灵活、避开重复序列、简化复杂基因组等优点，且开发的SNP分子标记性价比高、稳定性好，在基因组中分布均匀，已在群体进化[3-4]、分子标记开发[5-6]、全基因组关联分析[7-8]、遗传图谱构建[9-10]及QTL定位[11]等研究上发挥了重要的作用。目前，SLAF测序技术已在陆地棉[12-13]、大豆[8]、南美白对虾[14]、苹果[11]等得到广泛应用。近年来对于柑橘重要园艺性状如柑橘果实无核[15]、果肉颜色[16]、果实酸度[17]等方面的研究越来越多。WANG等[18]在114个芽变甜橙品种中共鉴定到2 321个结构变异，进一步鉴定到877个转座子跳跃事件。遗传和基因功能研究表明，这些转座子在低酸和无酸的突变体中插入到转运子基因或者其调控基因前，从而影响了果实的pH及柠檬酸含量。Shi等[19]发现柑桔中柠檬酸含量的变化和p型质子泵基因的表达高度相关。【本研究切入点】目前对于甜橙园艺性状的调控基因报道主要集中在可滴定酸含量变化上，对于脐橙的“脐”形成的相关基因以及影响柑橘果实重量的基因尚未见报道。【拟解决的关键问题】对240份甜橙种质的SLAF-seq测序数据结合连续两年的表型数据，采用Fst方法与XP-CLR获得不同类别甜橙与性状相关性较高的SNP候选位点，进而筛选出与可滴定酸含量、单果重、果脐的有无相关的候选基因，为后期的育种工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

240份甜橙种质资源均来自重庆市北碚区的国家柑橘种质资源圃（重庆），详见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取和文库构建春季采集甜橙幼嫩叶片装在1.5 mL离心管存于液氮中，样品交北京百迈客科技有限公司进行DNA的提取、质检、建库以及测序。选取适量DNA用于文库的构建，采用I+III酶对基因组DNA进行酶切。并且针对得到的酶切片段进行3′末端加A处理、连接Dual-index测序接头，随后对每个样品进行PCR扩增并纯化，将纯化后的样品进行混样，电泳后割胶回收350—400 bp的DNA条带，用于在Illumina测序平台上进行测序。

表1 本研究中所采用的240份甜橙种质资源

续表1 Continued table 1

1.2.2 可滴定酸含量与单果重测定可滴定酸含量与单果重测定均参照《柑橘种质资源描述规范和数据标准》[20]，从树体东、南、西、北4个方位随机采取10个成熟果。

1.2.3 单核苷酸多态性（SNP）鉴定下机后的短读序列经过质量控制后，利用BWA软件[21]将高质量的测序短读序列比对到甜橙参考基因组上（https://www. citrusgenomedb.org/analysis/174），并使用GATK[22]和samtool[23]两种方法鉴定SNP，以两种方法得到的SNP标记交集作为最终可靠的SNP标记数据集。

1.2.4 候选基因预测目前最基础、利用率最高的检测自然选择的方法就是计算群体之间的Fst值，Fst可以认为是在分层群体中不同亚群间相关基因的度量，Fst的取值范围为0—1，数值越大，表明群体间分化程度越大，其筛选到的差异基因的可靠性就越高[24]。对240份甜橙种质资源在重庆北碚进行连续两年的果实可滴定酸含量、单果重、有无脐的分析，选择低酸（可滴定酸含量低于0.5 mg/100 mL）和高酸（可滴定酸含量高于1 mg/100 mL）、大果（单果重高于250 g）和小果（单果重低于150 g）、有脐和无脐等分化群体，利用plink软件逐位点计算Fst，将其阈值设定为0.25，再用柑橘基因组数据库（https://www.citrusgenomedb. org/）对筛选获得的显著性较高的SNP位点进行基因注释。同时对上述三类分组以选择扫描窗口为50 kb、步长为10 kb进行XP-CLR分析，计算出的XP-CLR正则化值后利用R软件包进行可视化。对筛选获得的XP-CLR最大值对应的位点利用柑橘基因组数据库进行注释。

1.3 基因表达分析

分别收获位于重庆市北碚区的国家柑橘种质资源圃（重庆）中的高酸甜橙品种果实（‘摩洛血橙’‘铜水72-1锦橙’‘康拜尔夏橙’）以及低酸甜橙品种果实（‘埃及1号糖橙’‘冰糖橙’‘冰糖橙（仁4）’）几个不同发育阶段的代表性果实，去除外果皮和中果皮后，将剩余的果肉组织切成小块后用液氮快速冷冻保存于-80℃冰箱中待用。采用Biospin多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取甜橙果肉总RNA，使用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus）将提取的RNA反转录成cDNA备用。

使用Primer3 Input（version 0.4.0）在线设计荧光定量引物（表2）以及基因克隆引物，内参基因为柑橘，于CFX96 TouchTM荧光定量PCR仪进行qPCR反应。扩增体系包含2 μL cDNA，上、下游引物各0.4 μL，Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix 5 μL，2.2 μL RNase Free ddH2O，共10 μL。反应程序为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s,共40个循环。每个处理3次重复。

表2 qPCR试验所用引物

1.4 基因克隆测序

使用Primer3 Input（version 0.4.0）在线设计基因克隆引物，引物名称为orange1.1g011684，正向引物序列为CTGCAAGCCGGGTACTTAAA，反向引物序列为TCCTACGTTTTTCCTGCTGTT。使用pClone007 Versatile Simple Vector Kit、Trelirf 5α Chenically Competent Cell（擎科生物）进行克隆测序。

1.5 数据分析

试验所得数据均采用Excel处理，并用SPSS 18.0进行差异性统计分析；使用GraphPad Prism绘制图形。

2 结果

2.1 测序质量

240份甜橙种质经过DNA质量检测、酶切建库和SLAF-seq测序共产生497.82 Mb短读数据，测序平均Q30为94.70%，平均GC含量为41.31%。高质量的测序短读数据通过BWA软件比对到甜橙参考基因组（citrus sinensis V1.1），群体样本与甜橙参考基因组的比对率为70.01%—76.95%，表明本研究中的样本与甜橙参考基因组有较高的遗传相似性，其中澳大利亚红夏橙的比对率最低，深红皮甜橙的比对率最高。GATK和samtools两种方法的SNP标记取交集，共得到1 467 968个高质量的SNP位点用于后续分析。

2.2 主成分分析

利用PCA分析法对240份甜橙种质进行主成分分析，发现无明显分组情况出现，说明甜橙的基因组较为混杂，利用基因组SNP数据不能将园艺学上脐橙、血橙、普通甜橙进行准确的划分。具体结果见图1。

2.3 群体遗传结构分析

为评价240份甜橙种质的群体结构，使用ΔK来划分亚群，当K=3时观察到最大的ΔK，表明240份甜橙种质可分为Q1、Q2、Q3三组，详见图2。其中Q1包含绝大部分的脐橙和血橙以及少部分的普通甜橙，Q2包含绝大部分的普通甜橙和少部分的脐橙，Q3包含一部分普通甜橙以及少部分的脐橙和血橙，并不能在园艺学层面上将其完全划分，这与PCA的结果一致。

BO：血橙 Blood orange；NO：脐橙 Navel orange；OSO：普通甜橙 Ordinary sweet。下同 The same as below

蓝色为Q1，红色为Q2，绿色为Q3 Blue refer to Q1, Red refer to Q2, Green refer to Q3

2.4 调控脐、单果重、可滴定酸园艺性状的相关基因预测

利用Fst分析比较了有脐（21）和无脐（25）有明显差异的两个类群（图3），在scaffold00042上发现了可能与果脐发育相关的snp位点，临近该位点的基因为orange1.1g044639m，该基因注释为生长素外排载体，编码生成的蛋白质属于PIN蛋白，参与生长素在植物体内的跨膜转运。在该位点的下游则是orange1.1g023641m，注释为含有RING结构域的与膜结构相关的基因，其在克里曼丁当中的同源蛋白注释为参与生长素的外排运输。利用XP-CLR方法在有脐（21）和无脐（25）两个类群中进行选择性清除分析，同样鉴定出生长素外排载体所在基因位置有最强的选择信号。

利用Fst比较分析单果重（46）和单果轻（52）有明显差异的两个类群（图4），鉴定了2个与单果重量相关的候选基因，均位于scaffold00042上。Fst得分最高的是orange1.1g023641m，SNP位于scaffold00042的234 747处，该基因被注释为含有RING结构域和膜相关的基因，参与E3泛素连接酶的合成。在该基因的上游为orange1.1g046891m，基因注释是-糖苷酶，其参与碳水化合物代谢过程，可能通过调节碳水化合物的合成来影响果实重量。利用XP-CLR方法在单果重（46）和单果轻（52）两个类群中进行选择性清除分析，同样鉴定出调控E3泛素连接酶所在基因位置有最强的选择信号。

图3 利用有脐和无脐两个甜橙群体计算的全基因组Fst值（A）和XP-CLR选择消除分析结果（B）

通过对240份甜橙种质在重庆北碚进行连续两年的果实TA含量分析，利用Fst比较分析低酸（28）和高酸（30）有明显差异的两个类群（图5），鉴定了3个可滴定酸的候选基因。根据Fst结果，显示在sacffold00019上有和TA显著关联的SNP位点，其临近基因为orange1.1g011684m，该基因注释为丙酮酸脱氢酶复合物二氢硫辛酰赖氨酸残基乙酰转移酶，其在柠檬酸循环中扮演着重要角色。该酶是由酰基转移酶生成乙酰辅酶A，之后草酰乙酸、H2O和乙酰辅酶A经ATP-柠檬酸合酶催化后，在线粒体内发生双向反应，生成CoA与柠檬酸。该基因的下游是orange1.1g002727m，注释为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PRP4同源物。在Fst得分较高的scaffold00012上鉴定到的是orange1.1g034502，注释为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase），该酶是利用ATP作为磷酸盐供体，催化目标蛋白上的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化的蛋白激酶。对该SNP位点的基因型分析表明，高酸品种基因型为T/T，低酸品种的基因型为C/C、T/C。利用XP-CLR方法在低酸（28）和高酸（30）两个类群中进行选择性清除分析，同样鉴定出丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶所在基因位置有最强的选择信号。

图4 利用轻果和重果两个甜橙群体计算的全基因组Fst值（A）和XP-CLR选择消除分析结果（B）

2.5 关于调控可滴定酸候选基因的初步验证

2.5.1 可滴定酸含量动态变化情况分别对‘康拜尔夏橙’‘摩洛血橙’‘铜水72-1锦橙’‘冰糖橙（仁4）’‘埃及1号糖橙’以及‘冰糖橙’在花后45、75、105、135、165、195和225 d果实汁胞中可滴定酸含量进行测定（图6）。

图5 利用高酸和低酸两个甜橙群体计算的全基因组Fst值（A）和XP-CLR选择消除分析结果（B）

结果显示，随着柑桔果实的发育，6个品种果实汁胞中的可滴定酸含量均呈现先上升后下降的趋势。在花后45 d，6个品种的TA含量并无明显区别，随后，‘康拜尔夏橙’‘摩洛血橙’‘铜水72-1锦橙’3个高酸品种的TA含量急剧上升。其中‘摩洛血橙’‘铜水72-1锦橙’的可滴定酸含量在花后105 d达到峰值，之后开始下降并在花后165 d趋于平稳，而‘康拜尔夏橙’的可滴定酸含量在持续增加。‘冰糖橙（仁4）’‘埃及1号糖橙’以及‘冰糖橙’3个低酸品种的TA含量在花后45 d之后的变化量明显低于‘康拜尔夏橙’‘摩洛血橙’‘铜水72-1锦橙’3个高酸品种。

2.5.2 利用qpcr对可滴定酸含量的候选基因进行初步验证在果实发育周期中，orange1.1g034502m在高酸品种群‘康拜尔夏橙’‘摩洛血橙’‘铜水72-1锦橙’的果实汁胞中，于花后45 d时的表达量最低，随后表达逐渐增加，在花后75 d达到峰值，其中在‘摩洛血橙’中的表达量最高，‘铜水72-1锦橙’次之，‘康拜尔夏橙’最低；在花后75—225 d呈现逐步下降的趋势。在低酸品种群‘冰糖橙（仁4）’‘埃及1号糖橙’及‘冰糖橙’中的表达水平也呈现微弱的先升高后下降的趋势，并且在花后75 d，高酸品种中orange1.1g034502m基因的表达水平明显高于低酸品种（图7）。

图6 6个甜橙品种可滴定酸含量和变化趋势

图7 orange1.1g034502m在6个品种不同时期的相对表达量

orange1.1g011684m在6个品种中呈现先升高后下降的趋势，在‘康拜尔夏橙’‘摩洛血橙’‘铜水72-1锦橙’‘埃及1号糖橙’‘冰糖橙（仁4）’中于花后135 d达到峰值，这与可滴定酸含量的变化趋势一致。在低酸品种（‘冰糖橙（仁4）’‘埃及1号糖橙’ ‘冰糖橙’）中的表达量平均值高于高酸品种（‘康拜尔夏橙’‘摩洛血橙’‘铜水72-1锦橙’）（图8）。orange1.1g11684m的cds序列在低酸品种中的1 314位发生碱基突变（G突变为A），导致甘氨酸突变为丝氨酸（图9）。

图9 orange1.1g011684m cds序列突变示意图

3 讨论

3.1 对于调控甜橙“脐”发生的基因预测

脐橙作为甜橙当中较为特殊的一类芽变品种，因其往往具有较好的果实品质，在市场上比普通甜橙受到更多的关注。到目前为止几乎没有调控脐橙“脐”生长发育的相关基因报道，推测脐橙的“脐”形成的原因可能与雌蕊发育有关，而生长素的极性运输在花的形态建成中扮演了重要的角色。NIE等[25]在对黄瓜的研究中发现半胱氨酸蛋白酶抑制剂样蛋白作为黄瓜中局部生长素分布的转录调节因子，其表达量影响着生长素的积累进而调控了黄瓜花器官的发生。在对紫花苜蓿的研究中发现生长素的极性运输会导致花发育出现异常[26]。而orange1.1g044639m基因参与生长素的极性运输，并且该基因参与编码的PIN蛋白对器官的发生，花粉、雄配子体与孢子体的发育都受影响[27]，这在一定程度上也可解释脐橙无核的原因，因为脐橙品种多数是花粉和花药败育的，因此推测该基因与脐橙“脐”的形成存在密切关系。

3.2 对于调控甜橙果实重量基因的预测

果实重量一直都是育种家比较关注的重要园艺性状。前人研究表明，E3泛素连接酶可能与果实重量的改变密切相关[28-30]。张永强[28]在对影响番茄大小的研究中发现可能与番茄果实的大小和重量有关。Song等[29]在水稻中发现一个定位于细胞质中的基因，缺失该基因会加速水稻籽粒灌浆的速度，从而改变水稻的千粒重。对拟南芥中一个带有E3泛素连接酶活性的基因研究发现，其转基因植株后代的籽粒相较于野生型明显增大，并且转基因拟南芥的千粒重高于野生型[30]。所以，E3泛素连接酶参与调控果实大小可能具有广谱性。本研究中发现的orange1.1g023641基因带有E3泛素连接酶活性，但是该基因是否参与调控柑橘果实的大小和重量还有待进一步深入研究。

3.3 对于甜橙中可滴定酸调控基因的预测

苹果酸、柠檬酸等众多有机酸是影响肉质水果风味的重要因素，而柑橘中的有机酸主要以柠檬酸为主[31]。因为柠檬酸和苹果酸都是三羧酸循环的产物，所以前人的很多研究都集中于三羧酸循环以及相关的代谢通路。DENG等[32]研究发现位于果实细胞线粒体内的柠檬酸合成酶活性与脐橙果实中的柠檬酸含量呈极显著正相关；Katz等[33]研究发现GABA途径以及和氨基酸合成有关的酶活性在脐橙果实柠檬酸下降阶段的表达水平明显增加，使位于代谢通路下游的琥珀酸含量增加。乙酰辅酶A作为生成柠檬酸的重要前体物质，由丙酮酸经过丙酮酸脱氢酶复合体的催化而生成。该反应需要3种酶连续催化，依次为E1（丙酮酸脱氢酶，EC1.2.4.1）、E2（二氢硫辛酰胺转乙酰基酶，EC2.3.1.12）和E3（二氢硫辛酰胺脱氢酶，EC1.8.1.4）。E2作为其中的关键酶，其参与编码的基因orange1.1g011684m cds序列中的第1 314位碱基由G突变为A，导致编码氨基酸的改变，可能影响相关蛋白质的活性进而影响乙酰辅酶A的合成，形成了最终可滴定酸含量的差异，该酶有磷酸化和去磷酸化两种形式。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶作为响应外界信号从而特异性催化蛋白质底物上的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化[34]，进而改变蛋白质酶的相关功能。其调控的结果可影响包括TCA循环、糖酵解等途径在内的相关酶的表达。本研究中Orange1.1g034502m表达水平伴随着TA含量的变化而出现同步的变化，推测可能是由于该酶磷酸化/去磷酸化影响了与柠檬酸合成、代谢以及转运途径相关酶的酶活，进而影响了甜橙果实中的TA含量。

4 结论

本研究采用SLAF-seq对240份甜橙种质资源进行基因分型，结合表型数据，对不同甜橙类群进行全基因组扫描获得Fst值。最终在甜橙果脐的发生、单果重和可滴定酸等园艺性状上筛选出了相关的基因（orange1. 1g044639m、orange1.1g023641m、orange1.1g023641m、orange1.1g046891m、orange1.1g011684m、orange1. 1g034502），这些基因可作为后期功能验证的候选基因，将为甜橙品种的定向改良提供重要依据。

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Mining Genes Related to Fruit Quality in Sweet Oranges Based on Specific Locus Amplified Fragment Sequencing

LI RenJing, SHEN WanXia, ZHAO WanTong, CHENG Li, LI Pei, JIANG Dong

Citrus Research Institute, Southwest University, Chongqing 400712

【Objective】By using specific locus amplified fragment sequencing (SLAF-seq) sequencing method and combined with fixation indices analysis on different sweet orange populations, the candidate genes related with some excellent traits in sweet orange were mined, so as to provide some candidate genes for the further molecular breeding in sweet orange. 【Method】SLAF-seq technology was used to genotype 240 sweet orange germplasm resources, which represented extensive genetic diversity and from different geographical origins accessions preserved in the National Citrus Germplasm Repository in Beibei of Chongqing. The genomic SNP genotype data were obtained using the sweet orange genome as the reference, and the Fst and XP-CLR values between different subpopulations were calculated. 【Result】A total of 497.82 Mb-reads were obtained by sequencing 240 sweet oranges accessions with SLAF-seq technology, after the sequencing reads were mapped on to the reference genome by BWA software, and a total of 1 467 968 SNPs were identified by GATK and samtools. The Fst and XP-CLR indices were used to screen out candidate genes related to three traits, including fruit navel occurrence, fruit weight, and titratable acid content. Those genes adjacent to the selected SNPs were called. The result showed that orange1.1G044639m and orange1.1g023641m which annotated auxin efflux vector were related to the formation of navel in sweet orange. SNP in orange1.1G023641m which encoded E3 ubiquitin ligase had the highest Fst score between two different single-fruit weight population, and orange1.1G046891m might affect fruit weight by regulating carbohydrate formation; orange1.1G011684m encoding dihydrolipoamide transacetylase of PDH, and the SNP caused a nonsynonymous mutation in its CDS region, which might determine the citric acid content in fruit; orange1.1G034502m encodes Serine/threonine protein kinase, annotated as phosphorylation dephosphorylation function also related with the citric acid content in fruit. 【Conclusion】In this study, the Fst indices were used to screen six candidate genes associated with three fruit traits in sweet orange by using SNPs from SLAF-seq data. Finally, the relevant genes were screened out for three horticultural traits, including navel occurrence, fruit weight and titratable acid content, and the identified candidate genes should be giving further investigation to explore their regulation mechanism in these traits.

SLAF-seq; Fst; XP-CLR; sweet orange; fruit weight; titratable acids content; fruit navel occurrence