雍素云，史先鹏，周楠，周永春，张雪婷

1.陕西省人民医院 药学部，陕西 西安 710068

2.陕西省人民医院 骨科，陕西 西安 710068

3.陕西省人民医院 康复医学科，陕西 西安 710068

氧化应激参与癌症发展的所有阶段[1]，活性氧（ROS）在恶性肿瘤前期过程中起着重要的致病作用。一方面，组织中产生的ROS 可以在相对较短的时间内被生长因子诱导，如表皮生长因子（EGF）和血小板衍生生长因子（PDGF）；另一方面，炎症细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的持续激活，通常需要大量的ROS的产生来支持[2-3]。细胞内的ROS 主要由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶（Noxs）产生。Noxs 作为电子供体催化NADPH 产生O2，继而产生ROS。Noxs 家族有Nox1-5、双氧化酶1（DUOX1）和DUOX2。Noxs 蛋白本身几乎没有催化活性，需要与多种调节亚基结合形成稳定的复合物才能发挥催化作用，包括p22Phox、p47Phox（异构体Noxo1）、p67Phox（异构体Noxa1）和p40Phox[4-5]。不同细胞中Noxs 的分布及功能也是不同的[6]。大肠腺瘤性息肉使个体易患结肠腺癌。Nox1 已被证明在高分化结肠腺瘤中过表达[7]。除结直肠癌中Nox1 和DUOX2 的上调以及胰腺癌中DUOX2 的上调外，还有大量证据支持几种人体实体瘤中Nox4mRNA表达增强，与未受累的邻近胃组织相比，胃腺癌中Nox1 和Nox4 显著增加[8]。

欧前胡素属于呋喃香豆素类化合物，主要来源于白芷、当归、名党参、水芹、福参、防风、羌活、蛇床子等，其中在白芷中含量较丰富[9]。研究表明，欧前胡素具有抗炎、抗高血压、抗过敏及抗肿瘤等作用[10-11]。近年来，关于欧前胡素影响药物代谢酶活性，影响心血管和神经系统等多种药理作用的研究逐渐增多，针对其药理作用的研究领域不断拓宽。因此，欧前胡素具有广泛的药理作用以及巨大的新药开发潜力。前期研究中，欧前胡素通过降低胞内ROS 水平发挥抗炎、抗高血压等作用[12]。近期研究报道，欧前胡素可以减少H2O2诱导的HepG2细胞的细胞死亡，并减弱了ROS 的形成，但没有显示出细胞毒性，这表明其可能通过ROS 清除活性对H2O2诱导氧化损伤具有细胞保护作用，降低癌细胞的扩展[13]。然而欧前胡素对其他肿瘤细胞胞内ROS 及Noxs 不同亚型的影响作用仍不清楚，本研究通过欧前胡素对胃癌及结肠癌细胞的ROS 及Noxs 影响作用，揭示其抗肿瘤作用新机制。

1 材料与方法

1.1 细胞

人胃癌细胞MKN-45购自武汉华尔纳生物科技有限公司；人结肠癌细胞HT-29 购自北京北纳创联生物技术研究院。

1.2 试剂与仪器

欧前胡素（批号HY-N0285，质量分数98%）购自美国MCE 公司；二苯基氯化碘盐（DPI，批号HY-100965）购自美国MCE 公司；二甲基亚砜（DMSO，批号D8371）购自北京索莱宝科技有限公司；二氢乙锭（DHE，批号S0063）购自碧云天生物技术有限公司；兔多抗Nox1（批号DF8684）购自Affinity Biosciences Pty Ltd.；兔单抗Nox2（批号ab129068）购自Abcam 公司；兔多抗Nox3（批号A3677）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；兔多抗Nox4（批号DF6924）、兔多抗Nox5（批号DF4219）购自Affinity Biosciences Pty Ltd.；HRP 标记羊抗兔二抗（批号BA1055）购自武汉博士德生物工程有限公司。

显影定影试剂盒购自天津市汉中摄影材料厂；CCK8 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；DMEM 培养基、1640 培养基、MEM 均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；胎牛血清购自依科赛生物科技（太仓）有限公司；氨苄西林购自阿拉丁公司；硫酸链霉素购自阿拉丁公司；胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；RIPA 强效组织裂解液购自碧云天生物科技有限公司；BCA 蛋白检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司；PVDF 膜购自美国Millipore 公司。

细胞培养皿、细胞培养瓶购自美国康宁CORNING 公司；电子天平购自上海博通公司；96孔培养板购自奈斯生物科技有限公司；电泳系统购自美国Bio-Rad 公司；转膜系统购自美国Bio-Rad公司；微量移液器购自ThermoFisher 公司；超净工作台购自苏州集团安泰空气技术有限公司；低速离心机购自湖南可成仪器设备有限公司；电热恒温培养箱购自日本ASONE 公司；FlexStation 3 多功能酶标仪购自Molecular Devices 公司；CO2 恒温培养箱购自日本SANYO 公司；倒置显微镜购自日本Nikon 公司。

1.3 方法

1.3.1 受试物配制 欧前胡素及DPI 用DMSO 配制成50 mg/mL 母液，-20 ℃温度保存备用。使用时，用对应培养基稀释到所需浓度。

1.3.2 细胞处理 MKN-45 及HT-29 细胞置于含10% FBS、100 μg 青霉素-链霉素双抗溶液和高糖DMEM 培养基中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜，细胞密度达到80%时按1∶3 比例对细胞进行传代，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.3.3 CCK8 法检测细胞增殖活性 取处于对数生长期，生长状态良好的MKN-45、HT-29 细胞，分为对照组（加入新鲜等体积培养基）及欧前胡素3、10、30、100 μmol/L 组，用0.25%胰蛋白酶溶液消化MKN-45、HT-29 细胞制成单细胞悬液，以5×103个/孔接入96 孔板；另设空白组细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜（在细胞孔周围孔内加入100 μL 无菌PBS）。每种药物及浓度均设3 个复孔，吸弃各孔培养基，各组细胞依次加入不同浓度欧前胡素培养24 h 后，每孔加入10 μL CCK8，37 ℃培养2 h，酶标仪测定450 nm 波长处的各孔吸光度（A450），实验重复6 次，计算细胞增殖率。

细胞增殖率＝（A给药－A空白）/（A对照－A空白）

1.3.4 胞内ROS 水平检测 取培养好的MKN-45、HT-29 细胞分别分为3 组，即对照组（加入新鲜等体积培养基）、欧前胡素组（加入欧前胡素100 μmol/L干预24 h）[14]、阳性对照（DPI）组（加入DPI 0.05 μmol/L 干预24 h）。用1640 完全培养基调整细胞密度到2.5×105/mL，接入6 孔板，每孔2 mL细胞悬液，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜。欧前胡素100 μmol/L 及DPI 0.05 μmol/L 孵育24 h，孵育完毕后，使用PBS 漂洗3 次，加入20 mL DHE荧光探针染料工作液孵育1 h，于荧光显微镜下观察并采集图像，使用Image Pro-plus 软件计算每组胞内ROS 水平，实验重复9 次。

1.3.5 Noxs 相关蛋白表达检测 分组同1.3.4 项下，欧前胡素及DPI 干预24 h 后，弃掉培养液，加入蛋白提取液（PMSF 与RIPA 比例为1︰100）冰上裂解，离心后使用BCA 法提取总蛋白，定量后的样品上样，每孔上样量为20 μL，电泳并转膜后封闭2 h，加入一抗，4 ℃冰箱孵育过夜，一抗抗体分别为GAPDH（1︰1 000）、Nox1（1︰1 000）、Nox2（1︰5 000）、Nox3（1︰1 000）、Nox4（1︰1 000），次日TBST 洗膜3 次后，根据一抗加入二抗，使用HRP 标记二抗（1︰10 000 稀释），室温摇床孵育2 h。使用TBST 洗膜3 次后，将ECL 试剂盒中A 液与B 液按1︰1 比例混匀，将工作液均匀滴加于膜上反应，于凝胶成像仪器下显色，胶片扫描后，用BandScan 分析胶片灰度值，实验重复9 次。

1.4 统计学方法

运用Graphpad Prism 9.0 软件作图并分析，各组数据之间差异采用单因素方差分析（ANOVA）处理，分析结果采用表示。

2 结果

2.1 欧前胡素对MKN-45 及HT-29 细胞增殖活性的影响

如图1 所示，与对照组比较，欧前胡素组MKN-45 及HT-29 细胞增殖活性均下降，且呈浓度相关性；30、100 μmol/L 欧前胡素可使MKN-45 细胞增殖率呈极显著性下降（P＜0.001）；10、30、100 μmol/L 欧前胡素可使HT-29 细胞增殖率呈极显著性下降（P＜0.01、0.001）。

图1 欧前胡素对MKN-45 及HT-29 细胞增殖活性的抑制作用（，n=6）Fig.1 Imperatorin inhibited the proliferative activity of MKN-45 and HT-29 cells (,n=6)

2.2 欧前胡素对MKN-45 及HT-29 细胞胞内ROS水平的影响

如图2、3 所示，与对照组比较，欧前胡素组MKN-45 及HT-29 细胞胞内ROS 水平均显著下降（P＜0.05），DPI 组也可使MKN-45 及HT-29 细胞ROS 水平显著下降（P＜0.01、0.001）。

图2 欧前胡素对MKN-45 和HT-29 细胞胞内ROS 荧光染色图Fig.2 Fluorescence staining images of imperatorin effected on the ROS level of MKN-45 and HT-29 cells

图3 欧前胡素对MKN-45 及HT-29 细胞胞内ROS 水平的抑制作用（，n=9）Fig.3 Imperatorin inhibited the ROS level of MKN-45 and HT-29 cells (,n=9)

2.3 欧前胡素对MKN-45 及HT-29 细胞Noxs 蛋白表达水平的影响

如图4、5 所示，与对照组比较，欧前胡素组MKN-45 细胞Nox1、Nox2、Nox3、Nox4、Nox5 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05、0.01、0.001）；欧前胡素组HT-29 细胞Nox1 和Nox2 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01），但对Nox3、Nox4、Nox5 蛋白表达水平虽有降低趋势，但无统计意义。

图4 欧前胡素对MKN-45 细胞Noxs 蛋白表达水平的影响（，n=9）Fig.4 Imperatorin inhibited the Noxs protein expression level of MKN-45 cells (,n=9)

图5 欧前胡素对HT-29 细胞Noxs 蛋白表达水平的影响（，n=9）Fig.5 Imperatorin inhibited the Noxs protein expression level of HT-29 cells (,n=9)

3 讨论

在大多数细胞和组织中，Nox-依赖性ROS 的产生与生物信号和病理生理功能有关[15]，例如心血管[16-17]、神经退行性[18-19]、癌症[20-21]和代谢性疾病等[22-23]。这是由于氧化应激与癌症细胞的细胞代谢密切相关。此外，氧化还原平衡的改变和被认为是癌症的标志，并与恶性进展和药物治疗耐药性有关。因此，针对ROS 与肿瘤相关联的研究将有一定的临床意义。本研究发现具有抗肿瘤活性的天然化合物欧前胡素，在抑制胃癌MKN-45 细胞及结肠癌HT-29 细胞的增殖率的同时，可以降低胞内的ROS水平，这说明其抗肿瘤作用可能与ROS 相关。

代谢和微环境相关改变产生的高活性氧水平有助于调节癌症细胞代谢[24]，而Noxs 酶在这一过程中起着关键作用。基于通用抗氧化分子在人体试验中的应用的治疗方法引起了人们的广泛关注，但仍缺乏选择性靶向氧化途径的特定药理学策略[25]。因此，由于Nox 同源物主要由增强的表达和/或激活机制调节，因此调节Nox 表达及其活性被认为是新的有前途的治疗方法。一些Nox 成员在不同的癌症模型中被发现失调，其中Nox1、Nox2、Nox4 是表达最频繁的成员。

Nox1 亚型在多种组织中表达[26]，但在结肠、前列腺和血管细胞中占主导地位[27]，其表达可由多种条件诱导。然而，Nox1 的异常激活和/或表达通过细胞代谢的放松调节参与了越来越多的疾病，包括动脉粥样硬化、高血压、炎症和癌症[26]。Nox1 在一些肿瘤中上调，并作为癌基因发挥作用[28-29]。这种上调对糖酵解升高至关重要，并在线粒体功能障碍的癌症细胞中提供额外的NAD+[29-31]。在因致癌Ras激活或p53 缺失而导致线粒体功能受损的癌症细胞和原发性胰腺癌组织中也观察到Nox1 上调。Nox1功能的阻断选择性地损害具有线粒体功能障碍的癌症细胞，导致细胞糖酵解减少，细胞活力丧失，并抑制体内癌症生长，这表明Nox1 是癌症治疗的潜在新靶点[28]。Nox2 衍生的ROS 产生增强是氧化微环境的原因，该微环境对肿瘤发生、肿瘤进展、细胞增殖[32]和细胞代谢[33]产生深刻影响。Nox2 依赖的ROS 生成诱导低氧诱导因子1α（HIF1α）的激活，从而刺激HIF 相关的癌症事件[32]。迄今为止，已观察到Nox4 参与多种恶性肿瘤，包括肺癌、肾细胞癌症、结直肠癌、胃癌。Nox4 衍生的ROS 在几种组织和细胞类型的不同病理生理过程中控制与细胞增殖、迁移、存活、转化、细胞代谢和代谢重编程有关的各种细胞过程。与Nox2 类似，Nox4衍生的ROS 参与HIFα 的激活。在胶质母细胞瘤中，异常的Nox4 依赖性ROS 生成通过介导HIF1α稳定来影响叉头框蛋白M1（FOXM1）的调节。转化生长因子β1（TGF-β1）介导Nox4 上调，进而促进ROS 的产生、生长、存活、缺氧和胶质母细胞瘤的血管生成。在人神经母细胞瘤SHSY5Y 细胞中也观察到Nox4 依赖性HIFα 的稳定，其中Nox4 的表达在缺氧条件下上调。在Nox4 敲除的癌症细胞中，HIF1α 靶向基因（如编码葡萄糖转运蛋白的SLC2A1）的表达被阻止，从而支持Nox4 介导的代谢重编程的相关作用[34]。

在人类的淋巴组织、睾丸和血管中已经检测到Nox5 的表达[35]。研究表明，Nox5 有助于血管和肾脏病理[36]。最近的一项研究表明，Nox5 在兔中对动脉粥样硬化具有潜在的保护作用[37]。Nox3 分布在内耳中，它对耳蜗的形成至关重要，前庭中的碳酸钙晶体负责检测线性加速度、重力和听觉[38]。此外，DUOX1 和DUOX2 在甲状腺中表达，对甲状腺激素合成至关重要[39]。但考虑到安全性和效益，应该尽量避免对DUOX1 和DUOX2 的药理抑制，以避免甲状腺功能减退和肠炎症[40]。因此，本研究深入探索了欧前胡素对2 种癌细胞MKN-45 及HT-29 的不同Noxs 亚型的影响。

本研究中，欧前胡素可以降低MKN-45 细胞中5 种Noxs，但是对不同Noxs 的抑制程度稍有不同，其中对Nox1 的抑制作用最强（P＜0.001），对Nox2及Nox4 的抑制作用强于对Nox3 及Nox5 的作用。在HT-29 细胞中，欧前胡素可以明显降低Nox1 及Nox2 蛋白表达水平（P＜0.05、0.01），对Nox3、Nox4、Nox5 蛋白表达水平有降低趋势，但无统计学意义。这说明欧前胡素对不同Noxs 的影响存在差异性，可能对Nox1 及Nox2 的作用相对较强，与其抗肿瘤作用存在相关性。

综上所述，欧前胡素抗肿瘤作用可能与阻断Noxs-ROS 信号通路有关，新作用机制的发现为抗肿瘤提供了新的治疗思路。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突