王 坤, 赵瑞杰, 张 茜, 李利峰, 赵 杨, 李喜朋

1.邢台市第三医院 神经内一科,河北 邢台 054000;2.邢台市人民医院 神经内二科,河北 邢台 054000

急性脑缺血在一定时间恢复血液供应后,其功能不但未能恢复,反而出现更加严重的脑机能障碍,这一现象称为急性脑缺血/再灌注损伤(cerebral ischemia/reperfusion injury,CI/RI)[1]。近年来,有研究报道,在急性CI/RI的发展过程中,脑组织中的炎性细胞因子释放明显增加,这些炎性因子能够触发一系列病理性级联反应,这些级联反应将直接或间接地导致细胞凋亡、血脑屏障破坏、脑水肿和出血性转化[2-5]。因此,抑制急性CI/RI发展过程中的炎症反应可能是一种有效的预防和治疗策略。菊科植物红花是一种传统中药材,该植物的干燥花朵被认为是一种良好的活血化瘀药。Xue等[6]研究发现,羟基红花黄色素A(hydroxysaffloryellow A,HSYA)是红花的主要成分,对心脑血管病具有显著疗效。然而,HSYA对于急性CI/RI作用机制的相关报道较少见。本研究通过建立大脑中动脉闭塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion and reperfusion,MCAO/R)损伤大鼠模型,探讨HSYA对于急性CI/RI的作用机制,以期为CI/RI的预防提供新思路。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 SPF级雄性SD大鼠50只,体质量240～280 g,由江苏邳州市东方养殖有限公司提供(SCXK 苏2022-0016)。

1.1.2 试剂 HSYA购于美国sigma公司(纯度>99.8%);戊巴比妥钠购于武汉汉恒生物公司;4%多聚甲醛购于北京索莱宝生物科技有限公司;NeuN抗体购于美国Santa cruz公司;苏木精-伊红染色试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司;酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购于北京索莱宝生物科技有限公司;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)试剂盒购于杭州酶联生物科技有限公司;NF-κB p65和GAPDH抗体购于美国赛默飞公司。

1.2.3 主要仪器 多功能酶标仪购于南京贝登电子商务有限公司;荧光显微镜购于德国Lavision Biotec公司;超低温冰箱购于美国赛默飞公司;低温离心机购于德国Eppendorf公司;电子天平购于上海拓西电子科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 动物分组及模型建立 所有大鼠的饲养条件如下:温度控制在21℃～23℃,55%适度恒定,12 h光照和12 h黑暗周期,自由获取食物和水。将大鼠随机分为5组:假手术组、模型组,以及HSYA低、中、高剂量组,每组各10只。参照参考文献[7]建立大鼠MCAO/R模型。首先使用0.3%戊巴比妥钠麻醉大鼠后,用钳分离左侧颈总动脉,将6-0尼龙丝从左侧颈总动脉切口插入大脑中动脉以阻断血液。阻断2 h后,拔除纤丝进行再灌注。当大鼠出现提尾时左前肢不能伸直、行走时向左侧旋转或倾倒时,可判断MCAO/R模型构建成功。

手术前30 min内,HSYA低、中、高剂量组的大鼠通过尾静脉分别注射10、20、30 mg/kg的HSYA,假手术组和模型组的大鼠均注射等量生理盐水。模型组和HSYA低、中、高剂量组均按上述方法建立MCAO/R模型,假手术组的大鼠仅在颈部剪口并缝合,但未发生MCAO/R。术后24 h,使用戊巴比妥钠将所有大鼠麻醉致死,取脑组织进行后续研究。所有动物实验均经本院实验动物伦理委员会批准通过。

1.2.2 氯化三苯基四氮唑染色 造模成功24 h后,深麻醉下断头,提取除小脑、嗅球和下脑干外的脑组织,转入PBS溶液中清洗,然后在-20℃冷冻20 min,切取组织块,获得2 mm冠状脑片。将切片显露于2%氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)溶液中,37℃避光水浴30 min。每隔5 min摇晃1次,以确保染色均匀。随后,将染色的组织样本用4%多聚甲醛固定过夜,第22天干燥用于摄影。运行Image-ProPlus 6.0软件获得尾部梗死面积(白色),根据层厚计算梗死体积。

1.2.3 苏木精-伊红染色 将完整脑组织分离、固定、洗涤、脱水后进行透明处理并通过石蜡包埋。获得后视交叉的冠状切面(5 μm)。然后,切片经二甲苯和乙醇脱蜡至水,再用苏木精-伊红染色。制备组织切片,显微镜下观察皮质神经元形态。

1.2.4 神经元凋亡率检测 通过TUNEL和NeuN免疫荧光双染检测大鼠脑海马区的神经元凋亡情况。采用细胞凋亡检测试剂盒和抗NeuN单克隆抗体进行免疫荧光双标记。在TUNEL标记前,将4 μm厚的脑切片与抗NeuN一级抗体(1:200稀释度)在4℃孵育过夜,随后在室温下与免疫荧光标记的二级抗体孵育1 h。对于TUNEL标记,切片与含有末端脱氧核苷酸转移酶和荧光素标记的脱氧尿苷三磷酸的反应混合物在37℃孵育2 h。室温下Hoechst染色5 min。采用全自动荧光显微镜拍摄染色结果。

1.2.5 酶联免疫吸附实验 用包被缓冲液将大鼠脑组织匀浆液稀释至1～10 μg/ml,每孔加0.1 ml,4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品0.1 ml于上述已包被的反应孔中,置37℃孵育1 h,洗涤。于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体0.1 ml,37℃孵育30～60 min,洗涤,最后一遍用磷酸盐缓冲液洗涤。应用多功能酶标仪检测吸光度。

1.2.6 蛋白免疫印迹实验 收集1.2.5实验中匀浆后的脑组织样本,使用蛋白裂解液获取总蛋白后,通过考马斯亮蓝法对各组蛋白样本定量。使用SDS-PAGE凝胶电泳法分离目的蛋白,电泳结束后将目的蛋白转移至PVDF膜上,然后在5%脱脂牛奶封闭,分别与一级抗体和二级抗体孵育、洗膜、显影,将获得的蛋白条带进行标记,应用Image Lab软件测定蛋白条件灰度值,并计算NF-κB p65蛋白的相对表达量。

1.2.7 实时荧光定量聚合酶链反应 收集1.2.5实验中匀浆后的脑组织样本,按照说明书在匀浆液中添加500 μl RNA提取裂解液,用于提取总RNA。利用逆转录试剂盒将每个样本的RNA逆转录为cDNA。以GAPDH为内参,使用SYBR Green对目的基因的表达量进行定量,所使用的引物序列见表1。

表1 引物序列

2 结果

2.1 HSYA对MCAO/R大鼠脑梗死体积的影响 TTC染色结果显示,与假手术组大鼠比较,模型组大鼠脑梗死面积显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组大鼠比较,HSYA低、中、高剂量组大鼠脑梗死面积显著减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 HSYA对MCAO/R大鼠脑梗死体积的影响

2.2 HSYA对MCAO/R大鼠脑组织结构的影响 苏木精-伊红染色结果显示,假手术组大鼠海马神经细胞排列整齐紧密,细胞核大而圆,细胞结构清晰。与假手术比较,模型组大鼠海马神经细胞排列紊乱,体积减小,细胞核形状不规则,部分细胞核皱缩,呈三角形;与模型组比较,随着剂量递增,HSYA低、中、高剂量组大鼠海马神经细胞的损伤程度逐渐恢复正常,细胞排列较为整齐,细胞核逐步增大变圆。见图2。

图2 HSYA对MCAO/R大鼠脑组织结构的影响

2.3 HSYA对MCAO/R大鼠脑组织神经元凋亡的影响 TUNEL和NeuN荧光染色结果显示,与假手术比较,模型组大鼠海马神经细胞凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,HSYA低、中、高剂量组的大鼠海马神经细胞凋亡率明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 HSYA对MCAO/R大鼠脑组织神经元凋亡的影响

2.4 HSYA对MCAO/R大鼠脑组织炎性因子水平的影响 ELISA与实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠脑组织中炎性因子水平显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,HSYA组大鼠脑组织中炎性因子水平显著降低(P<0.05)。见图4。

图4 HSYA对MCAO/R大鼠脑组织炎性因子水平的影响

2.5 HSYA对MCAO/R大鼠脑组织中NF-κB p65表达水平的影响 蛋白免疫印迹结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠脑组织中NF-κB p65表达水平显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,HSYA低、中、高剂量组大鼠脑组织中NF-κB p65表达水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图5。

图5 HSYA对MCAO/R大鼠脑组织中NF-κB p65表达水平的影响

3 讨论

近年来,MCAO/R动物模型通常用于模拟大脑中动脉闭塞发病后的病理状况,已被广泛用于各类新药的开发研究中[8-10]。本研究建立了大鼠MCAO/R模型,以探讨HSYA对CI/RI的影响。有研究报道,局灶性CI/RI通常会引起缺血皮质神经元的形态学改变和功能障碍,24 h后导致最严重的脑梗死,大脑中动脉的供血区域有明显的梗死灶[11-12]。本研究建立MCAO/R大鼠模型后,与假手术组大鼠比较,模型组脑梗死面积显著增加,海马区域神经细胞排列紊乱、核仁消失、部分核质皱缩,炎性因子水平显著增加,这提示本研究的MCAO/R大鼠模型建立成功。

有研究报道,HSYA具有较好的抗炎、抗氧化作用,对于心脑血管病具有显著疗效[13]。如Zhang等[14]研究报道,HSYA是一种潜在的神经系统保护剂,可抑制大鼠脊髓损伤过程中的氧化应激、炎症反应和细胞凋亡的发展。此外,HSYA还是一种治疗动脉粥样硬化的天然产物,其可抑制泡沫细胞形成,改善血管内皮细胞功能障碍,抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移[15-16]。在本研究中,通过向MCAO/R大鼠注射HSYA后,MCAO/R大鼠脑梗死面积显著减少,神经细胞的损伤程度和凋亡率降低,脑组织中炎性因子水平显著降低。这提示,HSYA能够降低MCAO/R大鼠脑组织中炎性因子水平,缓解大鼠CI/RI。NF-κB p65是NF-κB家族成员之一,NF-κB是一种多效性转录因子,且炎症反应与NF-κB p65的异常激活密切相关[16]。本研究结果发现,在MCAO/R大鼠脑组织中,NF-κB p65显著增加,然而,HSYA低、中、高剂量组中,随着剂量增加,NF-κB p65表达逐渐降低。因此,HSYA的抗炎作用可能与抑制NF-κB p65表达相关。

综上所述,HSYA能够降低MCAO/R大鼠脑组织中炎性因子水平,缓解大鼠脑缺血/再灌注导致的神经细胞损伤,且这一作用可能与抑制NF-κB p65表达相关。HSYA可能是预防CI/RI的有效药物。