宋 雯，陈 曦，余 君，胡路路，陈 雄，王 志

（1.发酵工程教育部重点实验室，湖北工业大学，湖北 武汉 430068；2.湖北省烟草科学研究院，湖北 武汉 430030）

2021 年国产手工雪茄销量超过2 000 万支[1]，但国产雪茄烟叶香气不够浓郁、化学成分不协调[2]，因此需要通过微生物、酶及一些化学作用共同完成雪茄烟叶的发酵以提升烟叶品质。利用生物发酵技术改善雪茄烟叶品质成为了一大研究热点[3]。微生物的生长代谢使得烟叶中的木质素、蛋白质等生物大分子降解或转化，形成一系列的挥发性香气物质，同时降低烟叶中的青杂气，进而提升发酵后烟叶品质[4-5]。迟建国[6]为了降低烟叶中木质素含量，从废弃烟草中筛选出一株白腐菌并用于烟叶发酵，使得发酵后烟叶木质素含量降低30%，并显著提升了烟叶品质；蔡文等[7]为了降低烟叶蛋白质含量，采用源自烟叶的高斯芽孢杆菌进行发酵，降低了烟叶总氮含量，且提高了烟叶中-紫罗兰酮、E-大马士酮等类胡萝卜素降解产物的含量。张倩颖等[8]使用冬虫夏草菌株发酵烟叶，提高了发酵后烟叶中茄酮等西柏烷类降解产物的香气含量，且感官质量评价明显提升。地衣芽孢杆菌作为一种遗传背景清楚的益生菌[9]，被广泛应用于食品发酵等[10-11]，许多发酵食品特征性风味化合物与地衣芽孢杆菌代谢特征关系密切[12-13]。目前地衣芽孢杆菌在烟草领域主要作为根际促生菌用于育苗过程[14-15]。

雪茄发酵过程中菌群演替规律对科学可控地设计雪茄发酵工艺具有重要意义[16]。由于传统分离培养技术的局限性，即使选择多种培养基和分离条件，也仅能从样品中分离出少量优势菌群[17]。而宏基因组测序技术可克服此缺陷，检测出样品中全部微小生物的基因组DNA[18]，全面地反映其微生物群落的真实组成，系统地分析发酵过程中核心微生物菌群和代谢通路的变化，并注释风味物质形成的相关基因。刘爱平等[19]通过宏基因组技术研究了四川麸醋的微生物组和风味形成相关基因，发现醋醅具备通过氨基酸代谢形成风味物质的基础。陈晓东等[20]通过宏基因组测序技术分析了不同产地的酸笋中菌群结构和代谢通路的差异，发现酸笋中的微生物差异与产地密不可分。

笔者在雪茄烟叶箱式发酵过程中施加地衣芽孢杆菌，结合宏基因组学技术研究了其对雪茄烟叶发酵后香气成分的影响，揭示发酵后雪茄烟叶发酵菌系的演替特征以及其与香气物质代谢的关系，为构建雪茄烟叶发酵香气物质代谢网络、提升其代谢效率提供有力支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）：从茄芯CX-14 表面分离得到，制备甘油管保藏于发酵工程教育部重点实验室。

LB 培养基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L， 氯化钠 10 g/L，pH 值 7.2～7.4，121℃灭菌20 min。

洗涤缓冲液：Tris-HCl 15.76 g/L，EDTA-Na218.612 g/L，NaCl 81.9 g/L，polyvinylpyrrolidone (PVP)20 g/L，Tween-20 1 g/L，pH 值8.0。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的活化取200 µL 甘油管保藏的地衣芽孢杆菌菌液接种到LB 液体培养基中，200 r/min 培养24 h 得到一级种子液；按接种量5%将一级种子液接种至LB 液体培养基中，200 r/min 培养24 h 得到二级种子液。

1.2.2 雪茄烟叶恒温恒湿箱发酵整箱烟叶重量25 kg。测定雪茄烟叶初始含水率，按照称重回潮法计算所需回潮水的量，使烟叶回潮至含水率34%，待水分平衡后装入纸箱，放入恒温恒湿培养箱中，37℃、80%湿度进行发酵（对照组）。按照接种量2×108CFU/g计算所需菌体的量，将地衣芽孢杆菌二级种子液以10 000 r/min 的速度离心5 min 后弃上清收集菌体，加入计算好的回潮水进行重悬，得到的菌悬液均匀喷洒在烟叶表面（地衣芽孢杆菌组）。发酵周期为30 d。

1.2.3 雪茄烟叶挥发性香气成分测定及感官评价样品预处理：样品去主脉后烘干，用粉碎机粉碎后过40 目筛后，使用同时蒸馏萃取装置提取致香物质[21]，使用GC-MS 进行分析。GC-MS 色谱条件如下。色谱柱：HP-5MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；升温程序：40℃保持2 min，以2 ℃/min 升至200 ℃，保持5 min，然后10℃/min 升至280 ℃；载气（He）流速1 mL/min；进样量1 µL；分流比10 ∶1。电子轰击离子源；电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；离子源温度230℃；质量扫描范围35～550 m/z。目标化合物的峰识别基于国家标准和技术研究所数据库（NIST14）进行对比。

感官评价参照覃明娟等[22]报道的方法，由湖北省烟草科学院完成。

1.2.4 雪茄烟叶宏基因组样品采集、宏基因提取及测序取10 g 叶片样品，剪切成段，加入100 mL 洗涤缓冲液超声15 min 后过滤，将收集到的滤液10 000 r/min离心10 min，弃上清收集微生物细胞，重复洗涤直至上清液几乎无色。放入液氮罐中冷冻30 s 后迅速转入－80℃保存。宏基因提取依据NEXTFLEX™ Rapid DNASeq Kit 试剂盒的操作说明书完成。PE 文库构建及基因组测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.2.5 序列质控与组装在测序实验中采用多个样品平行混合测序，各样品中的序列均引入了一段标示其样本来源信息的Index 标签序列。根据Index 序列区分各个样品的数据，提取出的数据以fastq 格式保存。基于原始测序数据，使用相应软件对其进行数据质控，剪切掉数据中的低质量及含N 的reads，获得后续分析需要的质量更好的序列。

1.2.6 基因预测与非冗余基因集构建此次使用MetaGene 对拼接结果中的contig 进行ORF 预测，并将核酸长度大于等于100 bp 的基因翻译为氨基酸序列。用CD-HIT 软件将所有样品预测出来的基因序列进行聚类，每个类取最长的基因作为代表序列，进行非冗余基因集的构建。使用SOA Paligner 软件分别将每个样品的高质量reads 与非冗余基因集进行比对，统计基因在对应样品中的丰度信息。

1.2.7 α 多样性、物种与功能注释及物种贡献度分析数据使用美吉云平台的在线工具进行分析。使用DIAMOND 软件将非冗余基因集与NR 数据库进行比对，并通过NR 库对应的分类学信息数据库获得物种注释，然后使用物种对应的基因丰度总和计算该物种的丰度，并在各个分类学水平上统计物种在各个样品中的丰度，从而构建相应分类学水平上的丰度谱。分别 利 用Chao 指数、Simpson 指数和 Shannon 指数公式计算细菌生态多样性指数。使用DIAMOND 将非冗余基因集序列与 KEGG 的基因数据库（GENES）进行比对（E-value ≤10-5），根据 KO、Pathway、EC、Module 对应的基因丰度总和计算该功能类别的丰度。然后基于样本的物种和功能的对应关系，进行物种与功能相对丰度之间的关联分析，找出特定物种的功能贡献度以及特定功能的物种贡献度。

1.2.8 数据处理测定数据为3 组平行试验均值，采用SPSS 26 和Excel 软件进行数据分析，并用Origin 2019b 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 地衣芽胞杆菌对雪茄烟叶发酵过程挥发性香味成分的影响

雪茄烟叶香气物质总量在某种程度上决定了雪茄的呈香[23]。苯丙氨酸转化产物可以赋予烟叶花香特征，增加余味的醇净感[24]；类胡萝卜素降解产物可以降低烟叶刺激性[5]。西柏烷类降解产物具有清新的香气，可以增加烟气的醇和感[21]。美拉德反应产物可以对于赋予烟草坚果等香气，使其香韵更加多样化[25]。这些香气成分的含量与雪茄品质密切正相关[5]。地衣芽孢杆菌对雪茄烟叶发酵前后挥发性香气含量和感官质量评价的变化如图1 所示。

图1 雪茄烟叶挥发性香气含量（a）和感官质量（b）评价的变化

发酵前烟叶中挥发性香气总量为398.2 µg/g，发酵后，自然发酵组（对照组）和地衣芽孢杆菌组分别达到878.5 和958.2 µg/g，分别比发酵前提高了1.2倍、1.4 倍。另外，地衣芽孢杆菌组也比对照组提高了9%。图1a 表明：发酵前烟叶中苯丙氨酸转化产物、类胡萝卜素降解产物、西柏烷类降解产物和美拉德反应产物分别为8.3、45.3、21.2 和9.1 µg/g。发酵后自然发酵组分别为15.2、64.6、27.4 和12.5 µg/g，地衣芽孢杆菌组分别为20.7、 93.0、 30.5 和14.7 µg/g，与发酵前相比均有提高。与自然发酵组相比，地衣芽孢杆菌组4 类挥发性香气成分依次提高了36%、44%、11%和18%。

雪茄发酵前后的感官质量评价。如图1b 所示：发酵前雪茄烟刺激性较强，杂气突出，香韵较弱且香气不够醇厚，烟叶整体的平衡感较差。发酵后，较自然发酵组而言，地衣芽孢杆菌组对烟叶杂气与刺激性降幅更大，香气醇厚感提升，余味更加醇净舒适，烟叶整体平衡感更加出色。

综合以上研究内容可知，相较于自然发酵组，地衣芽孢杆菌组香气含量提升明显，内部化学成分协调，感官评价较好。

2.2 宏基因组测序与质控结果

Illumina 测序得到宏基因原始序列，如表1 所示，经质控、去宿主处理，两组样品每个平行分别得到reads 数约为 5 100 万、4 300 万、4 500 万、4 700 万、5 300 万、5 300 万条。对优化后序列拼接组装获得的 contigs 进行 ORF 预测，后基于ORF 预测基因进行聚类、构建。

表1 宏基因组测序的质控及组装信息

N50（N90）：将各contigs 序列按长度大小排序，扫描各条序列的长度值并进行累加。当累加值第一次超过所有序列总长度的50%（90%）时，此时扫描到的序列，其长度值即为N50（N90）；相比序列平均长度，N50（N90）更能准确表示此次序列拼接的效果[26]；组装结果显示，各组 N50 均大于 500 bp，表明组装良好，可用于进行后续分析。

2.3 茄烟叶发酵宏基因组 NR 物种注释

NR 是非冗余蛋白质氨基酸序列库，将构建的非冗余基因集与NR 数据库进行比对可以获得物种分类学信息。由图2 的NR 注释结果来看，在域水平上，细菌的相对丰度高达 93.0%～97.9%，表明在高温快速发酵过程中细菌是烟叶发酵香气生成及其他的主要承担者。

图2 不同处理发酵后菌群域水平物种分布

α 多样性指数可表示群落物种组成的多样性，因此对2 组的细菌进行了α 多样性分析。Chao 是用chao1 算法估计样本中物种总数。Simpson 也用来估算样本中微生物多样性，Simpson 指数值越大，群落多样性越低。与Simpson 指数相反，Shannon 值越大，说明群落多样性越高。自然发酵组和地衣芽孢杆菌组的细菌α 多样性指数显著性差异如图3 所示：从chao 指数来看，较自然发酵组而言，地衣芽孢杆菌组的chao 指数更大，表示地衣芽孢杆菌的物种总数更多，且2 组的差异极显著。从simpson 和shannon 指数来看，地衣芽孢杆菌组的simpson 明显小于自然发酵组，而shannon 指数明显大于自然发酵组，表示地衣芽孢杆菌组的群落多样性更高。

图3 不同处理发酵后菌群α 多样性差异指数校验图

在属水平上（图4），葡萄球菌属（Staphylococcus）是发酵后烟叶表面唯一优势属，相对丰度占比高达91.7%。杨勇等[27]发现葡萄球菌属对腊肉中的培根风味形成有着重要影响。其次为烟草菌属（Nicotiana），在自然发酵组和地衣芽孢杆菌组的相对丰度分别为1.2%和4.3%。

图4 不同处理发酵后菌群属水平物种分布

在种水平上（图5），尼泊尔葡萄球菌（Staphylococcus nepalensis）占比高达55.7%～67.2%，丰度大于0.5%的种几乎被葡萄球菌属和烟草菌属包揽，与属水平结果一致。但丰度大于0.5%的种中并未发现地衣芽胞杆菌，可能是地衣芽孢杆菌不可耐受雪茄发酵的最高温度，也可能是烟叶中存在未知的因素，不适宜地衣芽孢杆菌生长。

图5 不同处理发酵后菌群种水平物种分布

由图6 可以看出，自然发酵组注释显示菌系中的微生物有1 295 个属，地衣芽孢杆菌组注释显示菌系中的微生物有1 615 个属。自然发酵组有255 个特有菌属，而地衣芽孢杆菌组有575 个独有属，增加了320 个属，且增加的菌属均为地衣芽孢杆菌组的特有属。这说明：相较于自然发酵组，地衣芽孢杆菌的添加提升了烟叶表面物种的丰富度。

图6 不同处理发酵后菌群属水平物种Venn 图

2.4 组间物种及差异分析

对自然发酵组与地衣芽孢杆菌组发酵后烟叶表面菌群进行差异分析，如图7a 所示：两组相对丰度前15 的菌属均存在显著差异。与自然发酵组相比，发酵后地衣芽孢杆菌组烟叶表面葡萄球菌属（Staphylococcus）丰度占比有所下降，但依然远高于其他菌属；而烟草菌属（Nicotiana）、假单胞菌属（Pseudomonas）、链球菌属（Streptococcus）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）丰度占比均有不同程度的提升。再次说明在雪茄发酵过程中地衣芽孢杆菌的施加可以改变雪茄表面微生物群落结构，增加菌群丰富度。

图7 不同处理组间物种（a）及功能（b）差异检验

自然发酵组与地衣芽孢杆菌组的雪茄表面物种功能进行差异分析，根据2 组间物种功能丰度的差异，可以获得2 组间的显著性差异功能（图7）。对2 组发酵相对丰度前15 的功能通路记进行分析，发现：地衣芽孢杆菌的施加使得雪茄烟叶发酵中氨基酸的生物合成、碳代谢等代谢通路的相对丰度均有不同程度的提升，暗示菌群可能增强了其代谢强度以维持自身生存，其中氨基酸的生物合成可能更有利于烟叶美拉德反应产物的合成[25]。氨糖与核糖的代谢通路增强有利于细胞生长。

2.5 雪茄烟叶表面微生物的功能贡献度分析

通过计算微生物各属水平在各代谢通路的相对丰度，可以展示雪茄烟叶发酵菌群与 KEGG 代谢通路之间的功能贡献度。如图8 所示，葡萄球菌属对2 组丰度排前10 的功能贡献度均超过了80%。结合属水平的 NR 注释结果，推测菌属的相对丰度是其对代谢通路功能贡献度重要因素。另外，假单胞菌属对双组分系统的功能贡献度更高，说明假单胞菌属有较强的应对多种环境刺激的能力；烟草菌属对核糖体的功能贡献度更高，核糖体蛋白是核糖体生物发生和蛋白质合成中不可或缺的物质。这说明雪茄发酵过程中施加地衣芽孢杆菌可以使雪茄烟叶物种丰富度增加，对于促进代谢功能有着积极的作用。

图8 不同处理发酵后物种与功能贡献度

3 结 论

采用地衣芽孢杆菌进行雪茄恒温恒湿箱发酵，结合宏基因组学测序技术与雪茄烟叶发酵前后挥发性风味物质的变化明确了各菌属在营养风味物质演变中的功能贡献度。尽管在属水平上，葡萄球菌属是发酵后烟叶表面唯一优势属，但地衣芽孢杆菌的添加改变了雪茄表面微生物群落结构，提升了烟叶表面物种的丰富度，增强了氨基酸的生物合成、碳代谢等代谢通路的活性。另外， 相对自然发酵而言，地衣芽孢杆菌的添加使烟叶中的苯丙氨酸转化产物、类胡萝卜素降解产物、西柏烷类降解产物和美拉德反应产物的含量分别提高了36%、44%、11%和18%，挥发性香气总量提高9%。降低了烟叶杂气与刺激性，提升了香气醇厚感，使得余味更加醇净舒适，烟叶整体平衡感更加出色。