耿雨欣，吴雅诗，黄曼林，侯丽萍

（广州大学生命科学学院，广东 广州 510006）

内分泌干扰物（Endocrine disruption chemical，EDCs）属于一种存在于自然环境中的、具有类激素效果的化学物质，它会对生命体内源激素的合成、分泌、转运和降解过程产生影响，从而对生命体的生殖发育、免疫、内分泌和神经系统造成损害，并可造成其后多代的内分泌代谢失调[1]。EDCs 主要来源于工农业生产和民众日常生活产生的废气、废水和废渣。大量文献表明，当前全球主要水体中均已含有多种EDCs。由于水体的流动性较强，EDCs 可以随水体流动进行长距离的扩散污染。因此，EDCs对水生动物的暴露毒理效应已经成为备受关注的全球性环境问题[2]。不同于常见的已知有毒化合物如杀虫剂、双酚A、二噁英等，天然和人工合成的5大类类固醇激素（糖皮质激素、盐皮质激素、雌激素、雄激素与孕激素）被发现是一类新型EDCs 且活性较强[3-4]。与雌激素和雄激素类物质的生态毒理学效应研究报道[5-7]相比，有关环境糖皮质激素的生态毒理学研究报道相对较少。

糖皮质激素作为一种类固醇激素，是由下丘脑—垂体—肾上腺轴调控，并由肾上腺皮质束状带分泌，其在生物体内是由糖皮质激素受体（Glucocorticoid receptor，GR）介导，随后发挥多种生物学功能。糖皮质激素以其抗炎症和免疫抑制作用在人类临床和兽医临床上应用广泛[8]。

由于污水处理不充分或直接排放，导致工厂废水、畜牧场排水和地表水等水体环境中含有不同浓度的糖皮质激素，从几十ng/L 到几百ng/L 范围不等[3-4]。研究表明，鱼类暴露于外源性糖皮质激素环境下，其生理生化和遗传过程均可能受到不良影响。例如，除了改变葡萄糖稳态以外，糖皮质激素还会影响免疫系统（如白细胞计数的减少和免疫抑制）和内分泌系统（如雄激素效应）[9]。Willi 等[10-11]研究表明，可的松或丙酸氯倍他索的生理效应主要包括使斑马鱼胚胎心率增加，减少其自发性肌肉收缩，并加速其孵化等；而地塞米松则被发现可使斑马鱼心脏体积增大，心肌细胞变大，心脏性能增强。尽管脊椎动物的生殖是由下丘脑—垂体—性腺轴来控制的，但糖皮质激素在机体生殖过程中也发挥着重要作用[12]。这可以由糖皮质激素受体和雌激素受体之间的某些相互作用来证明。例如：糖皮质激素受体的激活阻止了雌二醇对雌激素受体表达的正向调节作用[13]，糖皮质激素和雌激素受体在鳟鱼大脑和垂体中的分布重叠[14]，皮质类固醇和性类固醇之间可能存在拮抗作用[15]，性类固醇调节皮质类固醇的产生，这些结果都进一步支持糖皮质激素受体和雌激素受体在生殖周期中存在相互作用这一论断。由此推断，皮质类固醇可能直接或间接参与卵母细胞成熟的控制，糖皮质激素和雌激素的代谢途径之间可能存在潜在干扰。因此，利用可的松评价糖皮质激素对雌性斑马鱼生殖损伤的毒理风险具有重要的现实指导意义。

除了探究糖皮质激素对亲代的毒性效应以外，学者们还发现EDCs 对其子代也可能造成不利影响，即化合物的跨代毒性效应。特别是当亲代接受暴露后无明显表型改变时，化合物对子代得影响可能更容易被忽视[16]。成年雌性斑马鱼暴露于低浓度的氟氢可的松21 d 后，其机体免疫应答和大脑昼夜节律相关基因的差异性表达显著，子一代幼鱼的孵化率、心跳和游动行为都在6 和42 ng/L 的氟氢可的松暴露下显著增加[17]。Ma 等[18]探究了环境中雄激素1,4-雄烯二酮（ADD）和雄烯二酮（AED）对斑马鱼的跨代效应，将受精后21～144 d 的F0代斑马鱼分别暴露于0～500 ng/L 的ADD 和AED 中，其F1代在清水中培养0～144 d，结果发现：在F0代中，ADD 和AED 均显著增加了雌鱼的数量，表现雌激素效应；在F1代中，高浓度（393 ng/L）ADD 组的雌鱼仍然显著多于雄鱼，占比为63.5%，而高浓度（428 ng/L）AED 组的雄鱼显著多于雌鱼，占比为78.7%。

为了探究可的松对雌性斑马鱼生殖系统是否具有毒性效应和跨代效应，研究以雌性斑马鱼及其子一代为研究对象，从形态学、病理组织学、行为学等方面评估糖皮质激素可的松的毒理风险。

1 材料与方法

1.1 试验材料

斑马鱼购于广州花鸟市场，鱼龄120 d 左右。水质监测采用Thermo 多道水质监测仪（Thermo Orion，520M-01，广州）。

主要试剂有可的松（CAS 53-06-5，上海安谱实验科技股份有限公司）、二甲基亚砜[DMSO，CAS 67-68-5，生工生物工程（上海）股份有限公司]、Bouin' s 固定液（飞净生物科技有限公司）。暴露试剂以DMSO 为助溶剂，配制成1 g/L 的母液，再依次稀释到相应浓度，4℃避光保存。

主要设备有体式显微镜及成像系统（Leica MC170 HD，新加坡）、高清摄像头（RERVISION RER-BXH2MP 0550，中国）以及动物轨迹跟踪系统（EthoVision XT，荷兰）。养殖容器为方形玻璃缸（25 cm×20 cm×20 cm）。

1.2 试验方法

将斑马鱼在实验室条件下稳定饲养2 周且无死亡状况出现后再用于慢性毒理试验，期间控制饲养水体环境的硬度、pH 值、溶解氧含量、温度、光周期等参数，稳定饲养和暴露期间采用自然光源，每日喂食2 次。

可的松暴露浓度分别为5、50、500 ng/L，以等体积的DMSO 为对照，共4 个处理，设置3 个平行，每个容器10 尾健康活泼的雌性斑马鱼（肉眼分辨），共120 尾斑马鱼。试验期间保证24 h 换一次水。暴露周期持续60 d。

暴露结束后，在交配产卵前夜选择发育良好、游动活跃的F0代鱼，挑出雌鱼和雄鱼以1 ∶2 的比例置于有隔板的产卵缸内进行交配试验（每缸中5条雌鱼，每暴露组共15 条）。第二日早上8：00 抽开隔板，30 min 后收集鱼卵。将产卵缸中的鱼卵收集到准备好的培养皿中并统计产卵数和孵化率。

每缸中挑选5 尾雌鱼于冰水混合物上晕眩并解剖，为了避免昼夜节律造成的试验差异，采用多人合作模式，保证在2 h 内解剖完60 尾。解剖前称量体重，解剖后称量性腺重量，并计算性腺指数（GSI= 性腺重/鱼体重量）。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 斑马鱼卵巢组织形态学观察解剖时将新鲜的雌鱼性腺组织置于Bouin's 固定液中，取固定24 h 后的性腺组织用酒精脱水，用二甲苯透明，石蜡包埋，切片，H&E 染色，中性树胶封片，最后在Olympus BX-51 显微镜下观察并拍照。

1.3.2 幼鱼发育形态学观察对子一代胚胎进行培养，分别在产卵后24、48、72、120、144 h 使用体视显微镜观察斑马鱼胚胎有无畸变发育，拍照记录。

1.3.3 幼鱼行为学测定受精后144 h 时选择形态正常的幼鱼记录其活动。将单条鱼（n=7）放置在圆形玻璃皿（半径为2 cm）中，在27±1℃的黑暗环境下观察 6 min，使用动物轨迹跟踪系统记录幼鱼的基本运动情况。

1.4 数据处理

使用IBM SPSS Statistics 26 统计分析软件分析试验数据，并进行单因素方差分析（one-way ANOVA）、差异显著性分析及t检验。试验数据以“平均值±标准差（Mean±SD）”表示。

2 结果与分析

2.1 可的松对亲代成年雌鱼性腺的毒性作用

由图1 可知，成年雌性斑马鱼卵巢中的卵泡发育包括核仁外周卵母细胞（PO）、皮质肺泡卵母细胞（CO）、早期卵黄卵母细胞（EV）、晚期-成熟卵黄卵母细胞（LV）等4 个阶段。对照组可观察到典型的成年雌鱼性腺切片，即主要由EV 和LV 占据的性腺切片（图1a）。通过比较不同处理各发育阶段卵母细胞的细胞数量百分比（图2）发现，与对照相比，5、50 和500 ng/L 可的松暴露处理的核仁外周卵母细胞（PO）比例分别上升了205.26%、341.92%和379.36%，差异极显著（P＜0.001）；对照组中几乎不可见皮质肺泡卵母细胞（CO，比例仅为0.03%），而5、50 和500 ng/L 处理组中CO 比例相对上升了13.77、10.78 和10.41 个百分点（P＜0.001）；EV 与LV 为发育更为成熟的卵母细胞，二者的细胞频率处于下降趋势，虽然EV 在可的松暴露组中的比例下降不具有统计学意义，但是LV 在50 和500 ng/L 可的松暴露组的比例分别比对照下降了88.62%和90.88%，差异显著（P＜0.05）。总体来看，可的松暴露显著提高了早期发育阶段卵母细胞的比例，同时高浓度暴露处理的晚期-成熟卵黄卵母细胞（LV）数量显著减少。这表明高浓度的可的松暴露会抑制卵母细胞发育。从图3 可以看出，各组成年雌性斑马鱼的GSI 指数和性腺重量未出现显著变化。

图1 成年雌性斑马鱼在不同浓度可的松中暴露60 d 后卵巢典型组织切片

图2 暴露可的松60 d 后斑马鱼卵巢不同发育阶段卵母细胞数量百分比变化

图3 成鱼性腺GSI（a）和性腺重量（b）

2.2 可的松对子一代胚胎早期发育的毒性效应

从表1 可以看出，高浓度（500 ng/L）暴露组的雌鱼无法产卵，而中浓度（50 ng/L）暴露组的产卵量比对照组少88.16%，孵化率也比对照组低67.51 个百分点，差异均达极显著水平（P＜0.001）；而低浓度（5 ng/L）暴露组的产卵量下降41.30%（P＜0.01），孵化率则降低6.71 个百分点，差异也达极显著水平（P＜0.01）。由此可见，暴露于可的松的成年雌性斑马鱼产卵量与孵化率随暴露浓度升高而降低，具有浓度依赖性。

表1 不同暴露浓度下产卵量和孵化率

从幼鱼行为测试热图（图4a）可以看出，5 ng/L可的松暴露组的子一代幼鱼活动明显增加，对其移动距离和移动速度的统计（图4b）也可以看出这一点，5 ng/L 可的松暴露组的移动距离和移动速度分别比对照组分别增加了455.28%和803.87%，差异极显著（P＜0.001）；50 ng/L 处理组的子一代幼鱼游动速度为60.92 cm/s，比对照组提升了504.37% （P＜0.001）。行为测试结果表明可的松暴露使得子一代幼鱼更加兴奋。由图5 可知，5～50 ng/L 可的松暴露下，斑马鱼子一代没有出现明显的畸变现象。

图4 不同处理幼鱼游动能力的比较

图5 胚胎发育形态学观察

3 结论与讨论

在脊椎动物中糖皮质激素作为一种甾体激素能直接作用于性腺，导致下丘脑—垂体—性腺轴功能被抑制，从而抑制性腺甾体激素的合成、延迟青春期的发育，干扰正常的卵巢周期和排卵[19]。该研究中高浓度可的松暴露后卵巢中PO 频率大幅升高，而EV 和LV 的频率下降，说明可的松慢性暴露能够抑制卵泡发育。除此之外，可的松慢性暴露成年雌性斑马鱼导致生殖损伤还表现为减少产卵数量，具体表现为产卵数量随暴露浓度升高而显著减少，并且经过高浓度（500 ng/L）暴露的雌性斑马鱼不能产卵。Lalone 等[20]的研究也表明，500 ng/L 的地塞米松暴露成年雌性黑头呆鱼21 d 后可降低成年雌鱼的产卵量。皮质醇被发现可体外抑制鳟鱼卵泡中性类固醇的分泌[21]。以上结果均表明糖皮质激素暴露对成年雌性斑马鱼具有生殖毒性。该研究中，5～50 ng/L可的松处理处理对孵化出的子一代形态学尚未产生明显的毒理效应，但行为分析中可以观察到明显的游动速度加快。在Willi 等[10]的研究中也得到这样的结果，胚胎分别暴露于丙酸氯倍他索、皮质醇和可的松下时，前两者胚胎出现明显肌肉收缩减少、心率以及孵化速度加快的现象，而可的松暴露组未出现类似现象，这可能是由于药物的生物学活性不同所致。该试验初步探究了环境浓度的可的松对雌性斑马鱼的生殖毒性作用和跨代效应，为深入研究可的松对斑马鱼生殖毒理机制提供了数据支持，后续可进一步研究可的松对斑马鱼性腺轴基因表达和相关通路的影响。