于 辉，肖 璐

（湖南科技大学生命科学与健康学院，经济作物遗传改良与综合利用湖南省重点实验室，湖南 湘潭 411201）

莲（Nelumbo nuciferaGaertn.）为睡莲科多年生水生植物。莲子是莲去胚的干燥成熟种子，含有生物碱、磷脂以及类黄酮等多种营养成分，是我国的特产优质资源，也是一种重要的出口创汇特色农副产品。产自湖南的湘莲具有低脂肪、高蛋白、口感好等特色，历史上作为进贡朝廷的珍品，因而被称为“中国第一莲子”。莲的生育期长，生长过程需肥量大。而大量化肥的使用不但导致耕地质量日趋恶化，还会影响莲子的质量。植物根际促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR） 是 一类生活在土壤或附生于植物根际并能定殖于植物根际系统、促进植物生长的有益菌。它可以创造良好的根际生态环境，在改善土壤理化性质、提高土壤肥力、降低化肥用量、抑制病虫害和减少农药污染等方面具有重要作用[1]。国内外已相继从水稻（Oryza sativa）[2]、小麦（Triticum aestivum）[3]、甘蔗（Saccharum officinarum）[4]、马铃薯（Solanum tuberosum）[5]、花生（Arachis hypogaea）[6]等作物根际分离培养出多种优良菌株并加以利用，但莲根际促生菌的筛选目前未见报道。笔者通过对湘莲种植基地土壤根际固氮菌和解磷菌的分离筛选，寻找有利用价值的菌株，并采用盆栽试验来验证其促生效应，为开发莲生物菌肥提供菌种资源，并为进一步促进湘莲产业的可持续健康发展提供有效途径。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 土壤样本采集湘莲根际土壤取自湖南湘潭湘莲种植基地。以“S”形采样法取5 个采样点，每个采样点各取根附着土壤样品1 kg，将5 个采样点的土壤混合，采用四分法弃多余土样，所采集的土壤置于冰盒（4℃）立即带回实验室。

1.1.2 培养基的配置LB 培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，H2O 1 000 mL，调节pH 值7.0～7.2，121℃灭菌30 min。PKO 液体培养基（无机磷细菌培养基）：NaCl 0.3 g，葡萄糖10 g，KCl 0.3 g，Ca3(PO4)25 g，(NH4)2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，MnSO40.03 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，H2O 1 000 mL，调节pH 值7.0～7.2，121℃灭菌 30 min。Ashby 无氮培养基：甘露醇 10.0 g，K2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KCl 0.2 g，(NH4)2SO40.2 g，CaCO35.0 g，pH 值7.2 ，121℃灭菌 30 min。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的筛选取1 g 莲根际土壤，将其加入装有100 mL 无菌水的锥形瓶中，恒温振荡箱中振荡30 min 形成土壤均质液。移液枪取1 mL 土壤液至9 mL 无菌水试管中，将土壤液依次稀释5 次，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释倍数的土壤液。将各个稀释梯度的土壤液按照稀释涂布平板法涂布至牛肉膏固体培养基，放入恒温培养箱培养12 h。挑取不同形态特征的单菌落，以点接种法接种在PKO、Ashby 培养基上，恒温培养3～5 d，通过观察Ashby培养基上的生长情况和PKO 培养基的透明圈情况，筛选出同时具备固氮和溶磷能力的菌株。

1.2.2 溶磷能力测定定性测定：采用点接种法，在PKO 培养基上接种筛选出的菌株，恒温培养，观察透明圈情况。培养至第7 天时，记录透明圈直径（D）和菌落直径（d），计算出D/d 值，初步评价各菌株的溶磷能力。定量测定：菌株接种于盛有50 mL PKO 液体培养基的三角瓶中，恒温摇床（30℃、180 r/min）上振荡培养3 d，将10 mL 培养液转移至离心管中离心15 min（4℃、10 000 r/min），收集上清液，用钼蓝比色法测定上清液中有效磷的含量。

1.2.3 固氮能力测定将筛选到的菌株摇至成菌液，在Ashby 培养基上接种菌液2.5 µL，30℃培养箱培养2～3 d，以无菌水接种为对照，观察培养基上菌株的生长情况，初步评定其固氮能力。

1.2.4 分泌IAA能力测定采用Salkowski 比色法判定菌株分泌植物生长素IAA 的能力。将供试菌株等量接种到装有King 液体培养基的试管中，28℃、120 r/min 培养2 d。将菌株培养液在5 000 r/min 离心3 min，取上清液1 mL 加比色液1 mL 在黑暗中静置30 min。设定10、30、50 mg/L 3 个IAA 浓度作为对照，比较粉红色颜色深度。

1.2.5 菌株鉴定采用菌落 PCR 方法扩增16S rDNA，所得产物交由生物工程（上海）股份有限公司测序。将测得的 16S rDNA 序列在数据库中进行序列检索，并与已测定的细菌菌株的 16S rDNA 序列进行同源性比较，构建系统发育树。

1.2.6 菌悬液的制备将菌株接种于 LB 液体培养基中，振荡培养（30 ℃、180 r/ min）48 h 。将菌悬液稀释成浓度108CFU/mL 备用。

1.2.7 促生菌对莲种子活力的影响挑选颗粒饱满的莲子，先用 l% 次氯酸钠溶液灭菌10 min，然后用无菌水冲洗 5～7 次晾干，置于菌悬液中于 25 ℃下恒温浸种 48 h。晾干后置于塑料盆中，每盆 20 粒，注入制备好的菌悬液50 mL，对照不加菌悬液，以无菌水浸泡。每个处理重复 4 次，置于25 ℃ 温室中做萌发试验。隔1 d 补充相应菌悬液或无菌水10 mL，以确保种子正常萌发。不定期观察种子萌发和幼苗生长的情况。第4 天测发芽势，第10 天测发芽率、苗长、不定根数、苗重及不定根干重。

1.2.8 促生菌对莲幼苗生长的影响取稻田表层土壤（0～20 cm）土样，剔除枯枝落叶及根系后，过2 mm 筛保存备用。土壤基本性状如下，有机质2.15 g/kg，全磷3.19 g/kg，速效磷3.64 mg/kg，全钾20.62 g/kg，速效钾21.22 mg/kg，pH 值 6.8。盆栽促生试验于 2021年11 月在湖南科技大学生科楼温室内进行。每盆装土100 g，将配置好的菌悬液50 mL 加入土壤中。莲种子催芽2 d 后，选取萌发状况一致的种子每盆种植2 颗，每盆加水150 mL 以没过莲子幼芽。待长势稳定后定植为每盆1 棵。对照处理土壤以等体积灭活菌悬液代替菌悬液。每个处理设置设 6 个重复，试验过程中不再施入其他肥料。莲子幼苗生长一个月（30 d）后采集植株样品和土壤样品，测定土壤矿质氮、速效磷、速效钾含量以及植株生物量、全氮、全磷、全钾含量。以上各指标的测定方法参考鲍士旦的《土壤农化分析》。

1.3 数据处理

利用SPSS 和Excel 软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 莲根际土壤固氮解磷菌的筛选

从湘莲根际土壤中分离出7 株同时具有固氮和解磷的细菌，分别命名为XL1、XL2、XL3、XL4、XL5、XL6、XL7。将分离得到的菌株接种至PKO固体培养基，36℃恒温培养7 d，记录透明圈直径（D）和菌落直径（d），计算D/d 值，结果分别为：1.10、1.40、1.28、1.66、1.37、1.50、1.75。其中，XL7 的D/d 比值最大，XL4 次之，XL3 和XL1 的D/d 比值最小。因此，选取上述4 株菌株定量测定其解无机磷能力，比较其溶磷差异。

定量测定检测结果与定性检测结果相一致，XL7溶磷能力最强，最高有效磷含量达到1.743 mg/L；XL4溶磷能力次之，最高有效磷含量达到1.145 mg/L；溶磷能力较差的是XL3 ，有效磷含量最高达到0.566 mg/L；溶磷能力最差的是XL1，有效磷含量最高达到0.561 mg/L。固氮能力方面，XL3、XL4、XL6、XL7 菌株在Ahbsy 固体培养基上生长良好，初步判断其固氮能力较好。另外3 个菌株长势较小，初步判断其固氮能力较弱。分泌IAA 的能力通过暗反应后的红色深浅来显示。通过观察颜色变化，可以推断XL4、XL6、XL7 具有分泌IAA 的能力，其中XL7 分泌IAA 的能力较强。另外4 个菌株没有发现明显的颜色变化，推断其没有分泌IAA 的能力。因此，选取XL7 为高效的固氮、解磷以及合成 IAA 的多功能促生菌，并通过莲子种子发芽和盆栽试验检测其促生效果。

2.2 XL7 菌株鉴定

将 16S rDNA 的测序结果和 GenBank 中已登录的核苷酸序列进行同源性比对，发现菌株与Bacillus altitudinis具有很高的同源性（图1），菌株XL7 鉴定为高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）。

图1 基于16S rDNA 基因序列构建的菌株XL7 系统发育树

2.3 促生菌对莲子种子活力的影响

促生菌对莲子种子发芽的影响如表1 所示。促生菌处理下的种子发芽势和发芽率都略高于对照组，但差异不显著。苗长、苗重和不定根重均显著高于对照，分别是对照的1.20、1.22 和1.36 倍。不定根数2 种处理下差异不显著，均在20 条左右。

表1 菌株对莲子种子活力的影响

2.4 促生菌对莲子幼苗生长及土壤速效养分含量的影响

2.4.1 促生菌对莲子幼苗生长的影响盆栽促生试验结果（表2）表明，与对照处理相比，促生菌株显著提高了莲子幼苗的生物量，为对照的1.25 倍。养分含量方面，XL7 菌株处理下莲子幼苗地上部的氮、磷、钾含量均高于对照。植株全氮含量达到显著性差异，增加了18.3%，而全磷、全钾差异则达到极显著水平，分别增加了80.5%和38.7%。推测XL7 菌株促进了莲幼苗地下部的生长，促使了其地上部生物量以及养分积累量的相应增加。

表2 接种菌株对莲幼苗的影响

2.4.2 促生菌对土壤速效养分含量的影响XL7 菌株接种莲子盆栽后对土壤中养分的影响如表3 所示。一个月后与对照相比，土壤中矿质态氮增加了5.3%，但差异不显著。速效磷和速效钾分别提高了31.8%和26.1%，差异显著。促生菌的固氮作用能够为作物提供氮素营养，在农业生产中可以相应降低化肥用量，从而有利于改善莲子的品质。

表3 接种菌株对土壤速效养分含量的影响

3 小结与讨论

从湘莲根际土壤中分离出7 株兼具固氮和解磷功能的细菌，并对其固氮和解磷能力进行了测定，发现4 株菌株具有较强的固氮能力，其中XL7 溶磷能力最强。采用Salkowski 比色法进一步比较了菌株产IAA 的能力，颜色变化显示XL7 分泌IAA 的能力最强。故选取XL7 进行下一步的促生研究。结果表明，接种XL7 能促进莲子的萌发，发芽势、发芽率、苗长、苗重和不定根重均高于对照。土壤中矿质态氮、速效磷和速效钾分别提高了5.3%、31.8%和26.1%。莲幼苗植株生物量、全氮、全磷和全钾分别增加了25.0%、18.3%、80.5%和38.7%。这说明XL7 菌株对湘莲具有良好的促生作用。

具备固氮和溶磷功能的菌株可以通过生物固氮或者生物溶磷为植物提供氮素及磷素营养，是微生物肥料中主要的菌株。Alam 等[7]的研究发现接种固氮菌（Azotobactersp.）使水稻干物质量、水稻产量及氮的积累量增加6%～24%。雷学军等[8]、梅新兰等[9]对玉米和甜高粱（Sorghum bicolor）根际溶磷菌进行分离和应用，发现接种溶磷菌的处理植株生物量均有提高。细菌可以通过直接或间接的方式促进植物生长，如产氨、铁载体、生长素、抗生素等[10]。如IAA 已被研究证明能够促进植物的生长并提高植物的抗逆能力[11-12]。Goswami 等[13]从盐渍地中筛选得到一株产IAA 的菌株Kocuria turfanensis2M4，盆栽试验表明该菌株能显著促进花生生长。促生菌株的实际应用效果是检验其能否发挥促生作用的重要指标。Shah 等[14]研究发现，用芽孢杆菌处理番茄（Solanum lycopersicum）能提高番茄种子的发芽率、幼苗活力指数和株高、根长、鲜重等生长参数。郭雨晴等[15]用筛选的株菌对高粱种子进行处理，与对照组相比，处理组的高粱幼苗发芽势、发芽率、芽长、根长、株高及鲜重均表现出促生作用。郭英等[16]盆栽试验表明，接种促生菌株可使大豆（Glycine max）幼苗株高增长，提高了大豆幼苗的茎干重、叶干重、根干重等。种子萌发状态影响着成苗率和幼苗质量，是关系田间植株质量的重要因素。此研究用筛选的菌株进行种子萌发试验，通过发芽率、发芽势、芽长、根长、苗长等探明种子活力的高低。结果显示促生菌处理下的种子发芽势和发芽率都高于对照组，但差异不显著，苗长、苗重和不定根重均显著高于对照，与赵伟进等[17]研究的结果相似。盆栽试验中，促生菌处理组显著提高了莲子幼苗的生物量，进一步验证了其对种子萌发和幼苗生长的促生效作用。

由于根际促生菌具有固氮、解磷、溶钾、产IAA 等能力，因此，能够改变根际土壤的理化性质，从而改善土壤肥力并促进植物对养分的吸收。如刘晔等[6]将筛选的根际菌株接种花生盆栽后，与对照相比，土壤中养分矿质态氮、速效磷、速效钾以及IAA 含量均得到提高。同时，由于根际菌株促进了花生根系的生长，从而使花生地上部的生物量以及养分积累量都显著增加。此试验中，接种了促生菌的莲土壤中矿质态氮、速效磷、速效钾含量均高于对照，地上部生物量显著增加。结合种子发芽试验和盆栽促生试验可以看出，根际促生菌影响的是整个植株地上部和地下部的统一系统。施用促生菌后，促进了植物根系生长，提高了对土壤养分的吸收效率以及利用率，而土壤养分的提高又反过来影响了植物的根系分布。在土壤与植株互相影响相互促进之下，植株生物量和地上部养分含量都得到了提高。在我国实现农药化肥零增长，“减肥增效”的大背景下，以根际促生菌为基础的新型微生物肥料的研发具有巨大的发展潜力和市场前景。