宋洁菲 周迎光

南京中医药大学连云港附属医院骨伤科，连云港 222004

静脉血栓栓塞症（venous thromboembolism，VTE）是指血液在静脉系统内不正常凝集的疾病，包括肺动脉栓塞（pulmonary embolism，PE）和深静脉血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）［1］。VTE主要临床表现为患肢肿胀、疼痛，出现不明原因的呼吸困难、胸痛，甚至死亡。中医将本病归于“股肿”，主要病机为气滞血瘀，水湿泛滥。《金匮要略·水气病脉证并治》中有：“血不利则为水，名曰血分”。可见血水相互转化，相互影响，临床上采用“活血利水”能起到较好防治效果［2］。

桃红四物汤出自清代吴谦《医宗金鉴·妇科心法要诀》，五苓散出自汉代张仲景《伤寒论·辨太阳病脉证并治》，分别为活血化瘀、利水渗湿的代表方，两方合用共奏活血化瘀、行气利水之效。目前，已有文献表明桃红四物汤和五苓散均具有抗血小板、抗炎作用，复方具有预防VTE的功效［3-5］，但桃红四物汤合五苓散发挥抗静脉血栓作用的具体机制仍未被完全阐明。

网络药理学是结合生物学、药理学、计算机学等所形成的一门新兴学科［6］，能够较全面系统地揭示中药及其复方的作用机理。本研究利用网络药理学方法探讨治桃红四物汤合五苓散抗静脉血栓生成的潜在作用机制，现报道如下。

材料与方法

1.桃红四物汤合五苓散相关靶点筛选

在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索关键词“熟地”“白芍”“当归”“川芎”“桃仁”“红花”“猪苓”“茯苓”“泽泻”“白术”“桂枝”，根据口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18［7］，筛选主要有效成分和靶点。将获得的靶点去重，利用Uniprot数据库（http：//www.uniprot.org/）统一命名。

2.VTE相关靶点筛选

在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）、Gene数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）、药物靶标数据库（TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/）中检索关键词“venous thromboembolism”。结果去重获得VTE相关靶点，利用Uniprot数据库统一命名。

3.构建药物-成分-疾病靶点网络图

利用Venny2.1.0获取药物和疾病的共同靶点，并绘制韦恩图。利用Cytoscape3.9.1软件构建药物-成分-疾病靶点交互网络图。

4.构建蛋白相互作用（PPI）网络

将筛选得到药物和疾病共同靶点导入STRING 11.5（https：//string-db.org/）在线数据库，构建PPI网络，设置物种来源为“Homo sapiens”，最小相互作用阈值为“highest confidence”（＞0.9），其余为默认值。导出结果并使用Cytoscape3.9.1绘制PPI网络图。

5.基因本体（GO）富集分析与京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析

使用Metascape平台（https：//metascape.org）进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，使用微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）可视化。

6.成分-靶点分子对接

选取药物-成分-疾病靶点网络中Degree值前5的靶点与有效成分进行分子对接。在蛋白质结构数据库（PDB，https：//www.rcsb.org/）中下载靶点的3D结构“.pdb”格式文件，在TCMSP数据库中下载3D结构的“.mol2”格式文件。将靶点和有效成分3D结构AutoDock Tools1.5.7，经过去水、加氢、分配电荷等处理，保存为“.pdbqt”格式文件。使用AutoDock Vina 1.1.2软件设置对接口袋，使用qvina-w软件进行盲对接。用结合能评价化合物与靶点的对接情况。

结果

1.桃红四物汤合五苓散有效成分和靶点

利用TCMSP数据库获得桃红四物汤合五苓散有效成分，共计103个。其中熟地2个，白芍13个，当归2个，川芎7个，桃仁23个，红花22个，猪苓11个，茯苓15个，泽泻10个，白术7个，桂枝7个。中药共有成分9种（表1）。检索TCMSP数据库，去重校正后获得人源靶点213个。

表1 桃红四物汤合五苓散中9种中药共有成分

2.VTE相关靶点

在GeneCards数据库中检索“venous thromboembolism”，取relevance score≥1，获得1 984个潜在靶点。在Gene数据库、TTD数据库中分别检索“venous thromboembolism”，与GeneCards数据库的结果去重，构成VTE相关靶点数据库，获得靶点共1 991个。

3.药物-成分-疾病靶点网络

利用Venny2.1.0平台，将有效成分靶点和疾病靶点取交集，绘制韦恩图（图1），获得68个共同靶点。将共同靶点导入Cytoscape3.9.1，构建药物-成分-靶点-疾病网络（图2）。使用NetworkAnalyzer工具分析网络特征，得到按照Degree排名前20的有效成分及靶点（表2）。

图1 有效成分靶点与疾病靶点韦恩图

图2 药物-成分-疾病靶点网络

表2 按照Degree排名前20的关键靶点和成分

4.PPI网络图

将共同靶点导入STRING11.5，构建疾病与药物关键靶点的PPI网络图，并通过Cytoscape3.9.1进行可视化，其中颜色越深、图形越大表示相关性越高（图3）。去除游离节点后，该网络涉及67个节点，743条边。使用NetworkAnalyzer工具分析，得到按照Degree排名前20的靶点（图4），主要为肿瘤坏死因子（TNF）、蛋白激酶B（AKT）1、白细胞介素（IL）1B、内皮生长因子（VEGF）A、基质金属蛋白酶9（MMP9）等。

图3 桃红四物汤合五苓散-VTE靶点PPI网络图

图4 桃红四物汤合五苓散治疗VTE的关键靶点（前20）

5.GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

GO富集分析生物学过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）3个类别，得到按照P值筛选每个类别排名前10的项目（图5A）。桃红四物汤合五苓散干预血栓形成主要涉及BP包括细胞迁移的正调控、炎性反应、对脂多糖的反应、血液循环、对氧含量下降的反应；CC包括膜筏、细胞外间质、血小板α颗粒腔；参与分子功能包括信号受体调节器活性、氧还原酶活性、丝氨酸水解酶活性等。KEGG富集分析在160个交集靶点中富集到相关信号通路有98条，通过P值筛选得到排名前19的通路（图5B），主要涉及流体剪切应力与动脉粥样硬化、癌症通路、脂质与动脉粥样硬化等信号通路。

图5 基因本体（GO）富集分析（A）与京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析（B）

6.分子对接验证

选择桃红四物汤合五苓散干预静脉血栓的中药复方网络中Degree值排名前5的有效成分：槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇，与PPI网络中Degree值排名前5的靶点：TNF、AKT1、IL1B、VEGFA、MMP9，分别进行分子对接并计算结合能（表3）。一般认为结合能小于-5 kcal/mol表示化合物与靶点结合能力较好［8］。所选化合物与靶点的结合能均小于-5 kcal/mol，说明结合能力较好。其中TNF与山奈酚、木犀草素，ATK1与β-谷甾醇，IL1B与豆甾醇，VEGFA与β-谷甾醇，MMP9与木犀草素结合能较低。将结果利用PyMOL软件进行可视化处理（图6）。

图6 分子对接模型（A为TNF与山奈酚，B为TNF与木犀草素，C为ATK1与β-谷甾醇，D为IL1B与豆甾醇，E为VEGFA与β-谷甾醇，F为MMP9与木犀草素）

表3 分子对接结合能（kcal/mol）

讨论

VTE是临床上最常见的血管疾病，癌症、手术等多种原因均可导致VTE的发生［9］，并有可能导致肺动脉栓塞等严重后果，是围手术期非预期死亡的主要原因［10］。如何更安全有效地预防VTE的发生成为当前亟待解决问题。临床应用已表明中医药在防治VTE方面疗效确切且不良反应较小［11］，但具体作用机制的研究仍较缺乏。

本研究初步筛选出桃红四物汤合五苓散有效成分共103个，关键靶点68个。其中，主要成分槲皮素、山奈酚和木犀草素均属于黄酮类化合物，能够调控多种信号通路，具有抗炎、抗氧化、改善血流动力学［12-13］等多种生物活性；β-谷甾醇、豆甾醇具有非竞争性抑制凝血酶发挥抗血小板和溶栓作用［14］。

桃红四物汤合五苓散干预VTE关键靶点主要为TNF、AKT1、IL1B、VEGFA、MMP9等。PPI网络图中，TNF是最核心靶点，在炎性反应中具有重要的作用。文献研究表明，槲皮素可以下调丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子-κB（NF-κB）等信号通路抑制TNF-α、IL-1β等炎症因子的产生［15-16］。山奈酚可以降低血清中包括TNF-α、IL-1β等多种促炎因子的表达，从而发挥抗炎作用［17］，保护血管［18］。木犀草素可以抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路，抑制IL-1β诱导NF-κB激活的过程［19］，逆转IL-1β诱导的Ⅱ型胶原降解［20］。TNF-α与IL-1β是重要的炎症因子，在细胞免疫反应中有重要的作用，可以与凝血系统的激活相互影响［21-22］，与VTE的发生具有一定相关性［23］。TNF-α、IL-1β等炎症因子可以促进炎性发生与血液高凝状态的形成，进一步损伤内皮细胞［24］。TNF-α激活后可通过PI3K/AKT等信号传导通路，最终激活NF-κB，导致IL-1β、IL-8等促炎因子共同激活，引起炎症的链式反应，进一步加重血管损伤。同时，活化的AKT还可增强缺氧诱导因子（HIF）1α活性，激活HIF-1信号通路下游靶基因，如VEGF转录［25］。VEGF在缺氧状态下可以促进一氧化氮产生，使环状鸟苷酸增加，也有促进血小板聚集、引起血栓的作用［26］。抗炎性反应或许可以成为抗血栓形成，治疗VTE的新方向。

MMP也是重要靶点之一。槲皮素、木犀草素可以抑制MMP-9的产生［16，27］。MMP具有降解细胞外基质的生物活性，具有促进血管生成的作用［28］。在生理状态下，它与其生物抑制剂金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP）在组织中保持动态平衡，MMP/TIMP失衡可能是VTE的原因之一［29］。但是，MMP在血栓的形成和再通中具有双向作用。在血栓形成过程中，MMP的高度表达使细胞外机制过度降解，损伤血管壁，增加血管通透性，与TNF、IL-1等促炎症因子共同作用，促进血栓的形成；在血栓再通阶段，MMP通过降低血管致密性，使血管更易向外扩张，促进新生血管形成，加速血栓的再通［30］。桃红四物汤合五苓散能否双向调节该通路仍需进一步研究。

GO和KEGG富集分析显示，桃红四物汤合五苓散干预血栓形成的靶基因主要涉及的生物过程包括细胞迁移的正调控、炎性反应、对脂多糖的反应等；细胞组分包括膜筏、细胞外间质、血小板α颗粒腔等；参与分子功能包括信号受体调节器活性、氧还原酶活性、丝氨酸水解酶活性等；主要涉及流体剪切应力与动脉粥样硬化、癌症通路、脂质与动脉粥样硬化等信号通路，与PPI关键靶点结果相符合。分子对接显示桃红四物汤合五苓散的核心成分与关键靶点的结合能力均较好，进一步验证了网络药理学结果，说明中药复方可通过多靶点、多通路发挥作用，反映了中医思维的整体观。

本研究仍存在一定局限性，如：筛选药物作用仅局限于数据库范围，未考虑多味中药有效成分之间的相互作用等，需要进一步实验验证。

综上所述，本研究通过网络药理学及分子对接技术，初步揭示桃红四物汤合五苓散抗静脉血栓的可能有效成分和作用靶点，并构建相关作用网络，为深入研究其作用机制提供了一定理论基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明宋洁菲：酝酿和设计试验，实施研究，采集数据，分析/解释数据，起草文章，统计分析；周迎光：酝酿和设计试验，实施研究，分析/解释数据，起草文章，对文章的知识性内容作批评性审阅，获取研究经费，行政、技术或材料支持，指导，支持性贡献