毕 珊,吴玉田,杨绍群,刘贵荣,王颖怡,赵正雨

(贵州省疾病预防控制中心,贵阳 550004)

交链孢霉又称链格孢霉菌,普遍分布于自然界中,是一种极为常见的腐生菌和植物病原菌[1-2],其产生的毒素种类达70 余种,主要包括交链孢酚(AOH)、交链孢酚单甲醚(AME)、细交链孢菌酮酸(TeA)和腾毒素(TEN)[3-4]。交链孢霉毒素对人体具有一定的致癌、致畸等慢性或急性毒性作用,如果多种交链孢霉毒素同时存在可产生协同作用,导致毒性增强[5-6]。葵花籽是备受欢迎的大众休闲食品,亦可作为食用油原料。葵花籽在储藏过程中会出现发热、发霉、变质等现象,易受到交链孢霉毒素的污染,其营养价值大大降低甚至会对人体造成伤害。因此,监测葵花籽中交链孢霉毒素的含量具有重要意义。

近年来,国内外已有较多关于食品中交链孢霉毒素检测技术方面的文献报道[7-13],其中高效液相色谱-串联质谱法由于具有灵敏度高、定性准确、重现性好的特点,已经成为主流方法,但我国尚未建立食品中交链孢霉毒素的限量标准,同时也鲜有关于测定葵花籽中交链孢霉毒素含量的报道。本工作针对葵花籽基质样品,提出了超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)测定葵花籽中交链孢霉毒素含量的方法,并用于实际样品检测,以期了解葵花籽中交链孢霉毒素污染状况,同时为葵花籽中交链孢霉毒素标准方法的研究开发提供基础依据。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

SCIEX QTRAP 6500＋型超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪;MPW-352R 型高速冷冻离心机;TTC-DC11型氮吹仪;Milli-Q 型超纯水机;Waters Oasis HLB固相萃取柱。

单标准溶液:100.0 mg·L－1,准确称取1.0 mg AOH、AME、TeA、TEN 标准品,用甲醇溶解、稀释,转移至10 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成质量浓度均为100.0 mg·L－1的单标准溶液。同法制备交链孢酚-d2(AOH-d2)、交链孢酚单甲醚-d3(AME-d3)、细交链孢菌酮酸-d13(TeA-d13)、滕毒素-d3(TEN-d3)的单内标溶液。

混合标准溶液:移取适量的单标准溶液,用甲醇逐级稀释,配制成AME质量浓度为10.0μg·L－1、TEN 和AOH 质量浓度为100.0μg·L－1、TeA 质量浓度为500.0μg·L－1的混合标准溶液。

混合内标溶液:移取适量的单内标溶液,用甲醇逐级稀释,配制成AME-d3质量浓度为100.0μg·L－1、TEN-d3和 AOH-d2的质量浓度为1 000.0μg·L－1、TeA-d13的质量浓度为5 000.0μg·L－1的混合内标溶液。

标准品:AOH,10 mg/瓶;AME,10 mg/瓶;TeA,10 mg/瓶;TEN,1 mg/瓶;AOH-d2,1 mg/瓶;AME-d3,1 mg/瓶;TeA-d13,1 mg/瓶;TEN-d3,0.25 mg/瓶。

乙腈、甲醇均为色谱纯;其他试剂均为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100.0 mm×2.1 mm,1.7μm);柱温40 ℃;进样体积3.0 μL;流量0.2 mL·min－1;流动相A 为1.0 mmol·L－1碳酸氢铵溶液,B 为甲醇。梯度洗脱程序:0～2.0 min时,B为5%;2.0～4.0 min时,B由5%升至90%,保持2.0 min;6.0～6.5 min时,B由90%降至5%,保持3.5 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源,负离子(ESI－)扫描模式;喷雾电压4 500 V;离子源温度500 ℃;雾化气1压力0.4 MPa,雾化气2 压力0.4 MPa,气帘气压力0.2 MPa,碰撞气压力0.1 MPa;多反应监测(MRM)模式。其他质谱参数见表1,其中“*”代表定量离子。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

用高速粉碎机粉碎葵花籽样品,取2.5 g,置于50 mL聚丙烯刻度离心管中,加入500.0μL混合内标溶液,混匀,放置过夜,加入25.0 mL 体积比为45∶10∶45的乙腈-甲醇-0.05 mol·L－1磷酸二氢钠溶液(pH 3.0)混合液,以转速2 500 r·min－1振荡提取10 min,以转速10 000 r·min－1离心10 min,转移上清液,并用水定容至30.0 mL,摇匀。取6.0 mL提取液,加入15.0 mL 0.05 mol·L－1磷酸二氢钠溶液(pH 3.0),摇匀,过Waters Oasis HLB固相萃取柱(预先用5.0 mL甲醇和5.0 mL水活化),用20%(体积分数)甲醇溶液淋洗,抽干固相萃取柱,用10 mL体积比为1∶1的含1%(体积分数,下同)氨水的甲醇-乙腈混合液进行洗脱,收集洗脱液,在水浴40 ℃下氮吹至近干,残渣用200.0μL甲醇复溶,并用水定容至2.0 mL,涡旋后按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

4种交链孢霉毒素混合标准溶液和实际葵花籽样品的总离子流色谱图见图1。

图1 总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatograms

2.2 固相萃取柱的选择

Waters Oasis HLB固相萃取柱是一种适用于酸性、中性和碱性化合物的通用性净化小柱,其良好的化学稳定性、高而稳定的回收率备受研究者的青睐。为验证Waters Oasis HLB固相萃取柱在葵花籽基质净化中的应用优势,采用空白基质加标的方式,在相同加标量(AME 的质量分数为2.0μg·kg－1,AOH 和TEN 的质量分数为20.0μg·kg－1,TeA 的质量分数为100.0μg·kg－1)条件下制备6个平行样,将Waters Oasis HLB柱(简称HLB柱)与实验室常用的Hypersep Retain PEP柱(简称PEP柱)、Hypersep C18柱(简称C18柱)的净化效果进行对比(除不加混合内标溶液外,样品提取与净化同1.3节)。

3种固相萃取柱净化下葵花籽基质样品中4种交链孢霉毒素的回收率结果见图2。

图2 3种固相萃取柱净化下目标物的回收率Fig.2 Recovery of targets purified by three solid phase extraction columns

由图2可知:固相萃取柱净化下葵花籽基质样品中4种交链孢霉毒素的回收率为46.3%～114%,HLB柱对葵花籽基质样品中目标物的回收率最好,其次是PEP柱、C18柱。原因在于HLB柱的吸附剂是水脂平衡的水可浸润的反相吸附剂,由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物,其吸附容量较高,吸附性较强,与C18柱键合了硅胶相比,吸附剂的表面积增大2～3倍,净化效果较好;PEP 柱采用高纯度、高渗透率的苯乙烯二乙烯基聚合物,键合脲功能团使它对极性和非极性分析物均有保留,其表面同时具有亲水性和憎水性基团,吸附能力也远高于C18柱,4种毒素在PEP柱上仍有较好的回收率;C18柱键合硅胶,适用于高保留性烷基键合相化合物,吸附能力弱,对含油脂的葵花籽基质中目标物的保留能力较差,且杂质干扰较大,不建议在含油性基质的净化过程中使用。因此,试验选择Waters Oasis HLB固相萃取柱为净化柱。

2.3 洗脱剂的选择

保证其他条件不变,试验考察了不同洗脱剂(5.0 mL甲醇＋5.0 mL乙腈、10 mL体积比为1∶1的含1%氨水的甲醇-乙腈混合液)的洗脱效果。结果显示:使用两种洗脱剂时,目标物的回收率无太大差别,但洗脱剂中有氨水时目标物峰形更为尖锐、信号更强,同时基线也更平滑。因此,试验选择10 mL体积比为1∶1的含1%氨水的甲醇-乙腈混合液作为洗脱剂。

2.4 标准曲线和测定下限

取混合标准溶液0,20,50,100,200,400,800,1 000μL置于不同的10 mL容量瓶中,均加入适量的混合内标溶液,依次加入甲醇500,480,450,400,300,100,0,0μL,用水定容,配制成AME 的质量浓度分别为0,0.02,0.05,0.10,0.20,0.40,0.80,1.00μg·L－1,TEN 和AOH 的质量浓度分别为0,0.20,0.50,1.00,2.00,4.00,8.00,10.0μg·L－1,TeA 的质量浓度分别为0,1.00,2.50,5.00,10.0,20.0,40.0,50.0μg·L－1的混合标准溶液系列,其中同位素内标TeA-d13的质量浓度均为25.0μg·L－1,AOH-d2和 TEN-d3的质量浓度均为5.00μg·L－1,AME-d3的质量浓度均为0.50μg·L－1。按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列,以目标物的质量浓度为横坐标,以峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标,绘制标准曲线。所得线性范围、线性回归方程和相关系数见表2。

表2 线性参数和测定下限Tab.2 Linearity parameters and lower limits of determination

以10倍信噪比(S/N)计算测定下限(10S/N),结果见表2。

2.5 精密度试验

随机选取3份阳性样品,每份样品制备7组平行样,按照试验方法测定,计算测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表3。

表3 精密度试验结果(n＝7)Tab.3 Results of test for precision(n＝7)

由表3 可知,各目标物测定值的RSD 为3.9%～12%,表明方法重现性良好,该检测方法的建立具有实际可操作性。

2.6 回收试验

对空白葵花籽样品进行低、中、高等3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平同时设计6组平行试验,按照试验方法进行测定,计算回收率和测定值的RSD,结果见表4。

表4 回收试验结果(n＝6)Tab.4 Results of test for recovery(n＝6)

由表4可知,目标物的回收率为75.0%～112%,测定值的RSD 为4.3%～12%,说明该方法的准确度良好,并进一步验证了方法的精密度良好。

2.7 样品分析

随机抽取市售散装、袋装葵花籽样品19份,按照试验方法测定4种交链孢霉毒素的含量,测定结果见表5。

表5 样品分析结果Tab.5 Analytical results of the samples

由表5可知:AOH、AME、TeA 和TEN 检出率分别为36.8%,52.6%,89.5%,84.2%。检出率和检出量最高的是TeA,平均值为1 890.16μg·kg－1,主要源于葵花籽在加工、运输和储藏期间发生霉变;TEN 的检出率次之,平均值为20.26μg·kg－1。可见,葵花籽中4种交链孢霉毒素均有不同程度检出,其中受TeA 毒素污染的风险最大,其次是TEN。

本工作提出了UHPLC-MS/MS测定葵花籽中交链孢霉毒素含量的方法,同时对3种常见的固相萃取柱进行了对比,对洗脱剂进行了考察,采用内标法定量,提高了定量结果的准确度。本方法具有操作简便、准确度好、灵敏度高等特点,适用于葵花籽中4种交链孢霉毒素含量的测定。对实际样品检测时发现,葵花籽中4种交链孢霉毒素的暴露水平高,污染情况严重,其中,TeA 和TEN 检出率高,且以TeA 污染情况最为严重。若经常食用受毒素污染的葵花籽或葵花籽油会对人体健康造成一定影响,相关部门应加强对交链孢霉毒素污染水平的监测与调查,保障人民的身体健康,同时为制定国家标准提供相关基础数据。