谢岭平,赖丽莎,彭兰芬 综述,付文金△ 审校

1.广东医科大学附属厚街医院检验科,广东东莞 523000;2.广东医科大学基础医学院,广东东莞 523808

聚集诱导发光(AIE)现象于2001年由唐本忠团队首次发现,AIE是指该类型的物质在稀溶液或单分子状态下不发光,当它在高浓度或者形成聚集态时,荧光效应增强。不同于传统有机荧光分子在低浓度(分散状态)时发射荧光、在高浓度(聚集状态)时易发生聚集荧光猝灭(ACQ)[1-2]现象,具有AIE性质的发光分子被称之为聚集致发射发光物质(AIEgens)。AIEgens作为新型荧光材料,因其优异的光物理性能特别适用于细菌成像检测和细菌感染治疗。本文回顾了近几年来AIEgens应用于细菌成像检测和细菌感染治疗方面取得的进展,现综述如下。

1 AIEgens概述

1.1AIEgens的发光机制 荧光分子可通过发光发热或分子物理运动等形式释放吸收的能量。如早期的AIE原型分子四苯基乙烯(TPE),在稀溶液中,TPE分子四个苯环通过自由旋转运动消耗能量,不发射荧光;当分子在聚集状态时,苯环的自由旋转空间受限,其分子高度扭曲的构型阻碍了分子间π-π相互作用,导致其荧光发射增强,称为分子内旋转受限(RIR)[3];另一类AIE分子内结构可通过以某一部分为轴而振动来消耗能量;由于聚集,分子内自由震动空间受限,激活发光分子,称之为分子内振动受限( RIV)。RIR和RIV均属于分子内运动受限(RIM)[4]。到目前为止,RIM被公认为是解释AIE现象的主要机制[5]。

1.2AIEgens材料性能特点 AIEgens作为新型荧光材料,具有一系列独特的优点,包括易制备、灵敏度高、背景低、聚集态发光效率高、光稳定性好、斯托克斯位移大等[6]。现有研究发现,AIEgens通过表面可修饰结构与光敏剂(PSs)、抗菌肽(AMPs)等多平台结合来合成具有多功能的AIE探针,以便捷高效的方式实现了AIEgens生物体应用转化,且合成探针均一性好,稳定性高,具有较高的可重复性及实用性[7]。在满足生物安全性及优异性能的前提下有利于建立多功能的生物成像、诊断和治疗系统,使AIEgens成为有前景和可靠的光学平台[8]。

2 AIEgens用于细菌检测

2.1AIEgens用于细菌成像检测 AIEgens具有优良的光物理性能,根据细菌细胞膜不同的结构,受调控的AIEgens可以选择性地点亮细菌,且不需要洗涤步骤[9],通过荧光信号可以有效地实现细菌的分类和鉴别,荧光定量检测结果可动态反映细菌浓度的变化,特别适用于细菌的荧光成像检测。ZHAO等[10]基于TPE开发了一种带正电荷的新型AIE分子材料(TPE-Py-Br),带正电荷的TPE-Py-Br和带负电荷的细菌膜之间的静电相互作用在细菌成像过程中起着关键作用。研究人员分别将革兰阳性菌表皮葡萄球菌和革兰阴性菌大肠埃希菌在10-6mol/L浓度的TPE-Py-Br溶液中染色10 min,由于其AIE特性,溶液中分散的TPE-Py-Br分子保持不发光,TPE-Py-Br通过静电力驱动与细菌膜结合形成局部聚集,激发出荧光,点亮细菌,两种细菌均能清晰成像,实现细菌荧光成像检测[10]。TPE-Py-Br和表皮葡萄球菌混合溶液的荧光发射强度比单独的TPE-Py-Br溶液的荧光发射强度强15倍。即使在没有洗涤过程的情况下,背景荧光非常低,发光效率高,避免了洗涤过程中的细菌丢失,简化了成像步骤,提高了通过荧光强度来量化细菌浓度的准确性。荧光开启细菌可视化,利用AIEgens能与多种细菌结合引起聚集诱导发光效应,其荧光强度与细菌量呈正比,高效的成像模式具有更高准确性和大线性关系区域的特点使AIEgens能够进行高通量抗菌药物筛选应用,为建立一种新型快速的细菌药敏试验方法提供了基础。

2.2AIEgens用于细菌活性辨别 为辨别活细菌或死亡细菌,有研究者开发了3种AIE活性分子,即TPE-2BA、TriPE-3BA和TPE-4BA,TPE-2BA是一种能与双链DNA凹槽结合的DNA染色剂,只有通过死亡细菌受损的细胞膜才能接触到双链DNA与其凹槽结合聚集激发出荧光[11]。因此,TPE-2BA 可以选择性地对死亡的细菌(包括革兰阳性菌和革兰阴性菌)进行染色,只对死亡细菌显示其AIE特性。TriPE-3BA和TPE-4BA的苯环通过与静电作用,与细菌细胞膜羟基结合聚集,导致旋转受到限制,激发荧光,因此TriPE-3BA和TPE-4BA都可用于活菌染色[11]。

2.3AIEgens用于革兰阳性菌和革兰阴性菌的辨别 革兰阳性菌引起的感染具有高发病率和病死率特点,对公众健康造成较大威胁。为快速区分出革兰阳性菌,便于指导临床进行早期用药,HU等[12]基于前期工作设计并合成了一种含吗啉和萘基的AIEgens分子,即2-{[(二苯基亚甲基)腙]甲基}萘(M1-DPAN),其中吗啉基团在选择性识别革兰阳性菌方面发挥了重要作用,通过改变微生物细胞壁之间的相互作用,聚集到革兰阳性菌细胞壁表面,发出强荧光。当革兰阳性菌、革兰阴性菌和白色念珠菌3种细菌同时与M1-DPAN作用20 min后,M1-DPAN在革兰阴性菌和白色念珠菌的存在下也能选择性地结合革兰阳性菌,只在革兰阳性菌上观察到荧光反应,能很好地区分革兰阳性菌、革兰阴性菌及白色念珠菌;在与金黄色葡萄球菌孵育后,M1-DPAN发射的荧光信号强且可以持续24 h,这有利于长时间动态可视化监测感染过程。ZHAO等[13]也合成了新型纳米工程肽接枝超支化聚合物(NPGHPs),该AIE探针能对多种细菌,尤其是革兰阴性菌有高效抗菌活性,其荧光强度与细菌量呈正比,并建立了大肠埃希菌浓度监测方法,检出限达1×104cfu/mL,此外,AIE 探针NPGHPs对细菌的选择性优于哺乳动物细胞,具有更广阔的临床应用前景。

2.4AIEgens对特定细菌的选择性成像检测 基于前期建立了各种细菌成像和检测方法[14],AIEgens也可被设计成高通量传感器阵列,用于快速准确地检测细菌。ZHOU等[15]通过在四苯基乙烯上以烷氧基链为连接基团引入带有明显疏水性差异的季铵盐,得到7种具有精确调节亲疏水性的AIE分子四苯基乙烯衍生物(TPE-AR),构建了一系列基于TPE-AR的传感器阵列来高通量地检测和鉴别病原体。所检测的7种微生物包括革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌、耐青霉素的金黄色葡萄球菌和粪肠球菌)、革兰阴性菌(大肠埃希菌、耐氨苄西林大肠埃希菌和铜绿假单胞菌)及白色念珠菌。由于这些不同亲疏水性的TPE-AR分子与病原菌间产生不同的多价相互作用,导致多样的聚集行为,每种病原菌都呈现出不同特征的荧光信号,每个传感器阵列都可以对不同的病原菌提供特征的荧光响应图谱,通过线性判别分析病原菌的荧光模式,实现对7种病原菌的有效鉴定,该传感器阵列也同样适用于检测病原菌混合物,具有快速(约0.5 h)识别、操作简单、高通量和免洗等优点,有望用于高通量的细菌药敏试验,具有为临床提供及时、可靠的病原菌筛查和药敏试验结果的巨大潜力。

3 AIEgens用于细菌感染治疗

细菌感染是人类健康的重大威胁之一,抗菌药物的过度使用导致了耐药菌株出现和传播,已成为人类面临的严重健康问题[16]。因此,迫切需要研发新的抗菌方法来对抗细菌感染。本研究总结几种基于AIEgens的图像引导诊疗系统。

3.1AIEgens用于光动力治疗(PDT)抗菌 PDT是一种利用特定波长的光激发光敏剂产生细胞毒性自由基和活性氧(ROS)以实现细菌感染治疗的方法[17],由于其非侵入性和高时空选择性的特点,具有抗菌效率高和不易产生耐药性等优势。PDT已经在肿瘤和细菌感染等疾病治疗方面展现出巨大的优势和应用前景[18]。基于AIEgens平台搭载光敏剂(PSs),具有强光敏性的AIE-PSs在有效消除多重耐药细菌方面表现出良好的性能[19],相对于传统荧光材料,其不受 ACQ效应制约,具有更好的PDT效果。KANG等[20]报道了一种带正电荷的近红外(NIR)光动力治疗探针(TTPy),由于更加小的单线态-三线态能量差,在白光的照射下能高效率地产生ROS,体外试验表明TTPy可通过PDT有效杀灭金黄色葡萄球菌;体内试验进一步地验证了 TTPy 在光照下能够明显抑制金黄色葡萄球菌引起的小鼠伤口感染,试验证明TTPy可选择性染色并显示出对革兰阳性菌的有效光动力学杀灭效果。此外,LEE等[21]进一步开发了一种能快速区分革兰阳性菌和高效光动力杀灭细菌的水溶性NIR AIEgens(TTVP),TTVP 仅孵育 3 s 就能对金黄色葡萄球菌实现特异性的免洗成像,随着孵育时间(约5 min)延长,大肠埃希菌逐渐被染色。因此,通过控制孵育时间,该探针能够超快速地区分革兰阳性菌和革兰阴性菌的混合样品。TTVP 在白光照射下能够更高效地产生ROS,金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌与TTVP一起孵育的存活率极低;TTVP 灯照组显示出最佳的伤口愈合效果,体外试验及体内试验都证实了 TTVP有良好的光动力杀灭细菌的特性[21]。探索具有AIE特性的PDT系统对研发新型抗菌材料有非常重要的指导意义。

3.2AIEgens用于对抗多重耐药菌 在耐药菌的抗菌光敏剂设计方面,万古霉素常用于治疗革兰阳性菌引起的严重感染[22],尤其是对其他抗菌药物耐药的耐甲氧西林菌株。有研究者通过AIE修饰万古霉素,开发了一种多功能探针(AIE-2Van)用于革兰阳性菌的PDT,在光照射下,AIE-2Van产生ROS并通过PDT过程选择性地杀灭革兰阳性菌[23]。与万古霉素相比,AIE-2Van对耐万古霉素肠球菌(VRE)菌株表现出更强的抗菌活性,最小抑菌浓度(MIC)为34.9 mmol/L,提示AIE-2Van对耐药菌株的杀伤能力在本质上是通过ROS的产生得到提升的[23]。另有研究报道了一种基于AIEgens的细菌膜嵌入式光敏剂(TBD-anchor),得益于其本身AIE特征的单线态氧发生单元和靶向细菌膜的三季铵盐,该光敏剂在水溶液里面具有高效的单线态氧产生效率与特异靶向细菌膜的功能,这有利于该光敏剂在白光光照下产生高效单线态氧而起到原位抗菌作用[24]。研究表明,TBD-anchor对革兰阳性菌和革兰阴性菌都具有非常高效的光动力抗菌能力,且在小于5 μmol/L浓度下TBD-anchor对革兰阴性菌、革兰阳性菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)都具有超过99.9%的杀菌作用;在800 nmol/L浓度下,TBD-anchor经10 min低剂量(25 mW/cm-2)的白光照射可以杀死99.8% MRSA[24]。这是首次报道基于AIE特征的光敏剂在低光强度下,在nmol级别浓度下依旧具有超强的多药耐药菌抗菌效果,为抗耐药菌光敏剂的设计提供了一个新思路。

3.3AIEgens用于生物偶联抗菌 生物偶联是指两种生物学上相关的分子通过共价键进行偶联,这里具体是指将AIE化合物共价键合到生物相关分子上的技术。噬菌体(PAP)是专门感染和裂解细菌的病毒,与抗菌药物相比更具有特异性,并对抗菌药物耐药菌株具有溶菌活性[25]。HE等[26]用带PDT活性AIE分子TVP偶联PAP合成(TVP-PAP),将靶向性、荧光成像和PDT效应集成在一起,受益于PAP生物学特性,非靶向细菌和正常哺乳动物细胞不受TVP-PAP影响。TVP-PAP在体外试验中几乎100%杀死了多重耐药的铜绿假单胞菌,在体内试验中加速了多重耐药细菌感染伤口的愈合[26]。此外,抗菌肽 (AMPs) 是小型基因编码的宿主防御蛋白,是哺乳动物免疫系统的关键组成部分,提供针对感染的内在防御,由于它们的广谱活性和较低的细菌耐药概率,它们已被作为有效的抗菌剂来治疗细菌感染,特别是多重耐药的细菌感染[27]。然而AMPs的杀菌机制仍不清楚,AIEgens和AMPs的偶联设计可实现实时成像监测它们与阴离子细菌胞膜表面的相互作用,以及由此导致的病原菌完整性的破坏。另有研究者构建了具有正电荷表面和AIE特性的抗菌聚合物肽多糖(COS-AMP),COS-AMP具有广谱抗菌性能,COS-AMP对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的MIC分别为241、334和233 mg/mL[28]。CHEN等[29]将抗菌肽HHC36和HBT结合在一起开发了一种具有AIE特性的抗菌肽 (AMP-2HBT),AIE活性探针能够高密度标记细菌膜,通过荧光成像,可实时监测AMP的抗菌过程。在抗菌肽HHC36上修饰HBT分子以后,并没有降低其抗菌活性。另外,透射电子显微镜和扫描电子显微镜结果证明,HHC36通过在细菌细胞膜上的不断聚集来破坏细菌膜完整性,从而实现有效杀灭细菌的目的。这些最新成果证明生物偶联AIEgens能够高效协同杀菌,在治疗细菌感染方面具有良好的应用前景。

4 小结及展望

通过AIEgens作为可修饰的多功能平台,实现了AIEgens在细菌成像检测和细菌感染治疗方面的应用。尽管在AIEgens基础上对细菌的成像检测和鉴别技术取得了较大进展,但对特定细菌的基于AIEgens的特异性成像检测并没有实现,例如AIEgens对结核分枝杆菌的特异性成像检测,未来应探索AIEgens在特定细菌中的应用,以实现特异性的细菌成像。目前,AIEgens用于细菌治疗研究集中于图像引导的光动力疗法,由于其具有非侵入性、高时空精度和低耐药性等特点,是一个有前景的研究方向。然而细菌的检测和治疗性能主要由聚集的形成决定,目前基于AIEgens的细菌成像检测技术的抗菌性能尚不能令人满意,还需要进一步研究AIEgens的相关结构,提高ROS生成率,优化其在体内的生物降解性和生物相容性,实现病原菌的特异性靶向,探索更多简便、经济的方法来合成具有细菌检测和抗菌剂协同效应的诊疗一体化材料,发挥精准抗菌的效果,促进AIEgens在细菌检测和抗菌剂开发方面应用的进一步发展。