张海鹏,李玉琼,刘正祥,段兴德,樊 荣,浦恩念,洪 梅,王 鹏,3,邵宗体,3

耶尔森菌属包含鼠疫耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌与假结核耶尔森菌这3种对人类致病的菌种[1]。鼠疫是一种对人类危害极为严重的自然疫源性疾病,历史上曾发生过3次世界范围内的大流行,导致1亿多人死亡,其中第三次大流行起源于中国云南[2-3]。2013年至今,甘肃、云南等地相继发生人间鼠疫,目前新的鼠疫自然疫源地和染疫动物不断被发现,部分省区鼠疫疫源地疫情回升[4],云南省鼠疫疫情仍旧是一个值得关注的公共卫生问题。小肠结肠炎耶尔森菌与假结核耶尔森菌作为肠道致病菌危害着人类的健康,世界范围内流行,除能引起胃肠道疾病以外,还能引起全身多个系统及器官的症状[5]。中国在20世纪80年代曾有过两次小肠结肠炎耶尔森菌的流行[6],而云南省是小肠结肠炎耶尔森菌的高发区。假结核耶尔森菌在我国尚没有暴发疫情的报道。云南金沙江流域地理位置特殊,生态环境复杂,且与其接壤的四川省鼠疫流行态势同样严峻,加之金沙江流域不断修建大型梯级电站,可导致局部生态环境改变,容易诱发鼠疫等传染病的暴发和流行。然而,近年来尚未对云南省金沙江中下游流域开展过关于致病性耶尔森菌的调查研究,流域范围大部分地区鼠疫监测防控不容乐观,长期静息或不明的疫源地一旦活跃出现疫情,可能由于准备不足或缺乏鼠疫防治经验,造成传播流行。本研究选取云南省金沙江中下游流域部分地区进行标本采集,分析3种致病耶尔森菌在该流域的分布和流行情况。调查3种对人致病性耶尔森菌的分布将有助于探讨鼠疫菌在自然界长期保存及变化的机理,为制订3种致病菌防治策略提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与材料 PCR仪(SENSO Lab Cycler PCR德国)、生物安全柜(Nu Air Lab GARPE SclassⅡ美国)、高速冷冻离心机(Eppendorf centrifuge 54美国)、电泳仪(Hoefer PS3008美国)、耶尔森选择培养基(CIN,OXIOD英国)、改良磷酸盐缓冲溶液(Sigma-Aldrich FULKA美国)、琼脂糖凝胶(Biowest Agarose西班牙)、PcR试剂(上海生工)、DNA 提取试剂盒(天根生化科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 标本采集 2018年至2020年从云南省昭通市永善县、绥江县、水富县,昆明市禄劝县以及楚雄州元谋县采集鼠肠回盲段、犬肛门拭子标本,及时放入10 mL改良PBS增菌液中低温保存运输到实验室放入4 ℃冰箱冷增菌21 d备检。

1.2.2 样本PCR初筛 按照DNA提取试剂盒说明书提取标本增菌液的DNA,对提取的DNA进行caf1、foxA、ail及inv基因的PCR初筛[7],扩增结束后1.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪观察结果。结果判读:caf1基因阳性为鼠疫耶尔森菌,foxA基因阳性为小肠结肠炎耶尔森菌,inv基因阳性为假结核耶尔森菌。ail基因阳性为致病性小肠结肠炎耶尔森菌。

1.2.3 可疑菌株分离培养 将PCR初筛阳性的冷增菌液接种在耶尔森菌选择培养基CIN琼脂平板上,经25 ℃、24 h培养后,观察并挑选可疑单菌落做进一步鉴定。

1.2.4 疑似阳性菌落PCR筛查 挑取适量上述培养出的可疑单菌落对其进行caf1、foxA、ail及inv基因的菌落PCR鉴定,阳性者进行分离纯化。

1.2.5 统计学分析 采用SPSS 17.0进行统计分析,分析各地区致病性耶尔森菌的携带率差异。用卡方检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 标本采集结果 共采集1 631份样本,其中昭通绥江县153份,水富县229份,永善县407份,昆明禄劝县381份,楚雄元谋县461份。详见表1。

表2 各地区小肠结肠炎耶尔森菌的分离情况Tab.2 Isolation of Yersinia enterocolitica by region

2.2 菌株分离结果 共分离到小肠结肠炎耶尔森菌38株,分离率为2.33%,其中永善县分离到小肠结肠炎耶尔森菌17株,分离率为4.18%;水富县分离到小肠结肠炎耶尔森菌8株,分离率为3.49%;禄劝县分离到小肠结肠炎耶尔森菌8株,分离率为2.10%;元谋县分离到小肠结肠炎耶尔森菌5株,分离率为1.08%。分离到假结核耶尔森菌1株,分离率为0.06%;未分离到鼠疫耶尔森菌。详见表1。

2.3 3种致病耶尔森菌统计分析结果

2.3.1 各地区3种致病性耶尔森菌的分离情况 经SPSS 17.0统计分析,云南省金沙江中下游流域5个县中,除昭通绥江县未分离到3种致病性耶尔森菌外,其余4个地区的3种致病耶尔森氏菌总分离率不完全相同(χ2=10.457 ,P<0.05),具有统计学意义,表示4个县3种致病耶尔森菌分离率不全相同,且昭通永善县的3种致病耶尔森氏菌总分离率大于其余地区。

2.3.2 各地区小肠结肠炎耶尔森菌的分离情况 经SPSS17.0统计分析,云南省金沙江中下游流域5个县中,除昭通绥江县未分离到小肠结肠炎耶尔森菌外,其余4个地区的小肠结肠炎耶尔森菌分离率也不完全相同(χ2=9.447,P<0.05),具有统计学意义,表示4个县小肠结肠炎耶尔森菌分离率不全相同,且昭通永善县的小肠结肠炎耶尔森氏菌分离率大于其余地区。

2.3.3 鼠类和犬类小肠结肠炎耶尔森菌分布情况 共采集样本1 631份,鼠回盲段样本985份、犬类肛拭子646份。其中鼠回盲段样本中分离到小肠结肠炎耶尔森菌24份,分离率为2.44%。犬类肛拭子样本中分离到小肠结肠炎耶尔森菌14份,分离率为2.17%。经SPSS 17.0统计分析,两宿主中小肠结肠炎耶尔森菌分离率差异无统计学意义(χ2=0.124,P>0.05),即不能认为鼠类与犬类小肠结肠炎耶尔森菌分离率不同。

3 讨 论

3.1 云南省金沙江中下游流域未发现鼠疫菌线索 云南省鼠疫疫区范围广泛,野鼠鼠疫疫源地主要集中在大理市与丽江市,家鼠鼠疫疫源地主要在云南省中南部地区,金沙江流域在建国之前曾有鼠疫流行的记载,但最近几十年并没有过鼠疫流行,由于与之毗邻的四川省鼠疫疫情时有发生,并且在鼠疫菌分子流行病学地理分布上,呈现青藏高原到四川再到云南的趋势,所以在金沙江流域进行鼠疫线索的调查很有必要,本次调查中只发现与鼠疫菌近源的小肠结肠炎耶尔森菌与假结核耶尔森菌,未发现鼠疫菌基因阳性样本,也未分离到鼠疫菌。需要继续对该流域进行监测,预警鼠疫的发生与流行。

3.2 云南省金沙江中下游流域存在小肠结肠炎耶尔森菌的分布 云南省金沙江中下游流域5个县共采集1 631份样本,共分离到38株小肠结肠炎耶尔森菌,分离率为2.33%,其中昭通水富县分离率为3.49%,昭通永善县分离率为4.18%,昆明禄劝县分离率为2.10%,楚雄元谋县分离率为1.08%,这4个地区的小肠结肠炎耶尔森菌分离率不完全相同,具有统计学意义,且昭通永善县分离率最高。2013年至2014年间,对丽江家犬进行3种致病耶尔森菌调查表明,小肠结肠炎耶尔森菌分离率0.8%[8]、云南省10个家鼠鼠疫疫源县犬肛门拭子中小肠结肠炎耶尔森菌分离率为1.64%[9]、梁河县家鼠鼠疫疫源地捕获的鼠的小肠结肠炎耶尔森菌分离率为0.4%(2/533)[10],即云南各地小肠结肠炎耶尔森菌的分布各不相同,且差异较大,金沙江中下游流域家犬与鼠中小肠结肠炎耶尔森菌分离率相比云南省其他地区而言处于较高水平。金沙江中下游流域鼠类小肠结肠炎耶尔森菌分离率与犬类小肠结肠炎耶尔森菌分离率差别无统计学意义,不能认为鼠类与犬类小肠结肠炎耶尔森菌分离率不同。此外,本次实验分离到的小肠结肠炎耶尔森菌均为非致病菌,表明该地区鼠间、犬间尚未形成小肠结肠炎耶尔森菌的流行。

3.3 云南省首次自鼠疫指示动物犬中分离到假结核耶尔森菌 假结核耶尔森菌广泛分布于世界各地,在已发现该菌的大多数国家,假结核耶尔森菌的感染率一般都稍低于小肠结肠炎耶尔森菌的感染率[11]。目前国内对该菌的研究处于起步阶段,于恩庶教授首先对假结核耶尔森菌进行了系统全面的论述,并证实了假结核耶尔森菌在福建省内有广泛流行,人畜均有感染[12]。假结核耶尔森菌的感染率虽低于小肠结肠炎耶尔森菌,但后者对人体的危害更大。假结核耶尔森菌具有侵袭力,有明显的淋巴嗜性,该菌经口进入人体消化道,移行至回肠,发生病理损害。部分患者体内细菌向深部播散入血, 移行到肝、脾,发生全身损害[13]。假结核耶尔森菌分布非常广泛,昆虫、鸟类、哺乳动物均可成为该菌的宿主。且广泛分布于各种水体及土壤等环境中,在各种清洁度的水源都曾分离到该菌[14]。人类由于接触被感染动物粪便污染的食物或直接接触造成感染[15]。本研究团队已经在云南省各地区进行致病性耶尔森菌研究10年之久,昭通永善县犬中分离到的假结核耶尔森菌是首次发现,下一步应开展对该菌的进一步研究,以判断其致病性强弱,是否有引起当地流行的趋势,同时也要求人们在生活中注重饮食卫生,加强健康教育。当地医疗机构应加强对该菌的监测,避免感染的发生。

利益冲突:无

引用本文格式:张海鹏,李玉琼,刘正祥,等.云南省金沙江中下游流域致病性耶尔森菌调查研究[J].中国人兽共患病学报,2023,39(8):822-825. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.090