潘晓威 孙爱娣 潘 政 梁耀辉 叶剑芝*

(1.中国热带农业科学院 农产品加工研究所,广东 湛江 524001;2.云南农业大学 热带作物学院,云南 普洱 665000)

橡胶籽(Rubber Seed)为一种橡胶树种子,由浅黄褐色并带有许多银灰色带状斑纹的硬皮质种壳和种仁构成[1-2]。橡胶籽粕富含大量的人体必需脂肪酸和多种蛋白质及各种人体必需氨基酸,是天然热带蛋白质饲料的优质原料,橡胶种壳可以生产活性炭,木塑产品等[3-4],具有生物可降解性和无毒特性,其壳制备的活性炭可应用于医学、食品、工业等多个领域[5]。橡胶籽仁主要由油脂、蛋白质、纤维素、淀粉组成,其中油脂含量最为丰富,占种仁的50% 以上[6]。

据调查,大量橡胶籽未被有效利用而被直接丢弃,WEN等[7]估计亚洲每年平均生产超过1 300万t橡胶籽,胶园里生产的大量种子仅有少部分用于育种,其余大量的种子长期废弃在胶园里,造成资源的严重浪费。因此有必要加强对橡胶籽开发利用的研究。

无机元素的含量与分布关系到植物的使用功效和营养价值,具有重要的研究价值[8]。目前,有关橡胶籽的研究多集中在橡胶籽油或者橡胶籽粕等领域的开发利用[9-12],或关于氨基酸等植物化学成分的相关研究[13],在无机元素含量分布领域的研究还有待进一步加强。在无机元素分析中,主要有原子吸收光谱仪、原子荧光光谱仪、电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)等设备进行检测[14-15],其中具备准确性高、精密度好、抗干扰能力强、检出限低等优点的ICP-MS 法在食品、环境等检测领域得到了越来越广泛的应用[16-17]。

数据分析中常用的主成分分析(Principle Component Analysis,PCA)和聚类分析法(Cluster Analysis,CA)等多元统计分析方法可将多个变量(多指标)的数据进行无量纲化处理,将批量数据合理地简化为少数几个综合数据[18]。

为全面评价橡胶籽的品质,本实验以不同产地橡胶籽(海南、广东、云南、广西、台湾、福建)作为研究对象,通过微波消解法结合ICP-MS内标法同时检测橡胶籽中Mg、K、Ca、Zn、Ti、Cu、Mn、Ni、Cr、Ba、Co、Cd、Se、Pb、V、As等16种无机元素的含量,分析不同产地橡胶籽中元素的含量差异,通过主成分分析和聚类分析筛选其特征元素,进行橡胶籽中无机元素的差异性分析,为我国橡胶籽的进一步研究和开发利用提供有力的基础数据参考。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

所用橡胶籽分别采自云南、广东、广西、海南、福建、台湾等6个产地(编S1～S5为云南、S6～S8为广东、S9～S11为广西、S12～S15为海南、S16～S17为福建、S18为台湾),分别挑选饱满、无坏损的橡胶籽,充分晾干后去壳,分别捣碎、研磨成粉末,分装并贴好标签备用。

消解试剂如无特别说明,均为优级纯,实验用水为二级水,HNO3质量分数为68%。

Mg、K、Ca、Zn、Ti、Cu、Mn、Ni、Cr、Ba、Co、Cd、Se、Pb、V、As等单元素标准储备溶液(1 000 mg/L),采购于国家有色金属及电子材料分析测试中心。

1.2 主要设备

X series Ⅱ 电感耦合等离子体质谱仪(美国赛默飞世尔),AUY120电子天平(日本岛津),FW100高速万能粉碎机(天津市泰斯特),MARS6全自动微波消解萃取仪(美国CEM公司),VB24 UP智能样品赶酸器(北京莱伯泰科)。

1.3 实验方法

准确称取 0.4 g(精确至 0.1 mg)制备好的橡胶籽粉末于消解罐中,加入8 mL硝酸后,预消解2 h,待冷却后根据表1程序进行微波消解。

表1 微波消解程序

微波消解结束待冷却后拧开内外盖排除气体,此时消解液呈淡黄色,150 ℃赶酸2 h,消解液冷却至室温,此时消解液清澈透明无沉淀,将其转移至 25 mL 比色管中,并用去离子水清洗消解管2～3次,定容至刻度,混匀备用,同时做空白样品实验[19]。

待测液在ICP-MS工作条件下进行测定。开机稳定20 min,测试之前将仪器状态调至最优。测试过程中确保仪器的吸液速率是恒定的[20]。

仪器工作条件见表2。

表2 ICP-MS测定参数

1.4 数据分析

采用 Excel 2010 软件建立不同产地橡胶籽样品元素含量的原始数据文档,采用 SPSS 26.0 软件进行统计分析,显著性水平为P<0.05。所采用的数据均为3次平行的测定值。

2 结果与讨论

2.1 方法的线性关系与检出限

在设定的仪器条件下测定制备好的混合标准溶液,测定结果见表3,各元素线性相关系数r均在0.999以上,说明各元素在标准曲线浓度范围内线性关系良好。

表3 各样品测定结果

表3 回归方程、相关系数及检出限

在设定的仪器条件下,测定经处理的11个空白溶液,根据11次测定结果计算标准偏差,得到方法检出限。由表3可知,橡胶籽中各元素的方法检出限在0.000 7～0.53 mg/kg,满足实验要求。

2.2 精密度与加标回收实验

按建立的检测方法进行处理并测定,平行测定6次,计算得到16种元素测定值的相对标准偏差(RSD)为1.5%～8.9%,均小于10%,说明该实验所用的测定方法重复性较好。

在橡胶籽中添加一定量标准溶液,按建立的检测方法进行处理并测定,计算加标回收率与RSD,结果表明,加标回收率为86.0%～96.3%,RSD为1.1%～8.8%,表明所建立的检测方法准确可靠,可用于橡胶籽中多元素的快速分析。

2.3 橡胶籽中无机元素含量

取6个产地样品,按照建立的检测方法进行前处理和上机测定。根据表3的结果,不同产地橡胶籽中均含有丰富的Mg、K、Ca、Ti、Mn、Ni、Zn等无机元素,且各类元素含量也存在较大差异。我国海南、云南、广东、台湾、福建、广西等6个产地橡胶籽中Mg元素含量最高,均在10 g/kg 以上,最高值可达33 g/kg;K元素含量达4 000～9 122 mg/kg;Ca元素含量达382～1 433 mg/kg;Zn元素含量在300 mg/kg以上;Ti、Cu、Mn、Ni含量也均在100 mg/kg以上。相对于一般的食品,橡胶籽中有害无机金属As含量较低,均为未检出,但Pb、Cd等重金属含量较高,在食用产品开发过程中需注意控制,避免产品中重金属含量超过食品安全国家标准的限量值,对人体造成伤害,进而损害橡胶籽的食用产业开发前景。

对6个产地橡胶籽的 15种元素进行方差分析(表4),结果表明,6个产地橡胶籽样品中的 Cr、Co、Cd、Ba、Pb、V、Se、Ti、Mn、Ni、Cu、Zn、Ca、K、Mg在地域之间存在显著差异(P<0.05)。不同产地橡胶籽样品中的元素含量各有特点。台湾产地橡胶籽中镁元素含量显著高于其他五个产地(P<0.05),福建镁元素最低,而钾元素低于其他五个产地(P<0.05);广东产地钙元素最高;6个产地中锌、钛、铜、锰、镍含量相似且锌元素明显高于其他四种元素。在广西与海南铬元素显著低于其他产地(P<0.05),而云南、广东、福建、台湾产地铬元素含量相接近;云南钡元素显著低于其他产地(P<0.05);云南、广东和台湾产地元素钴显著高于其他产地(P<0.05),广东和海南镉元素含量显著低于另外4个产地。因此,从橡胶籽中多元素的含量差异可以看出其无机元素含量受不同生长土壤、水文等环境因素的影响,与朱周俊等[21-22]的研究结果基本一致。

表4 不同产地橡胶籽测定结果

2.4 无机元素图谱

以元素种类为横坐标、相对含量为纵坐标绘制无机元素指纹图谱,由于6种产地橡胶籽中16种无机元素含量数量级差别较大,故将其调整至同一数量级(Se、V扩大1 000倍,Pb扩大100倍,Cd、Co扩大10倍,Ti、Ni、Mn、Cu缩小10倍,Ca、K缩小100倍,Mg缩小1 000倍)。由图1 可知,不同产地橡胶籽元素相对含量的变化趋势在一定程度上基本一致,说明橡胶籽在元素含量分布和元素种类上整体接近,但也能看出有部分元素在不同产地的相对含量存在一定差异,不同产地的环境因素还是会导致种植物含量的差异,借此也可通过差异性信息来分析不同产地的变化情况。

图1 不同橡胶籽无机元素图谱

2.5 主成分(PCA)分析

主成分分析法现广泛应用于实验数据分析,通过降低维度的作用提取出少数几个相互无关而又能够充分反映原始变量信息的综合指标(即主成分)。剔除未检出的元素As,以不同产地15种无机元素的含量为指标进行主成分分析(PCA),对数据进行降维处理[23],得到各主成分特征值、贡献率及累积贡献率(表5)。主成分分析结果显示,前4个主成分(PCA1-PCA4)的特征值分别为6.370、3.211、1.677、1.145,方差贡献率分别42.468%、21.403%、11.182%、7.637%,累积贡献率达80.69%,可知前4个主成分即能够代表橡胶籽中无机元素的整体特征信息,故对前4个成分的载荷矩阵进行深入分析。由表6可知,前4个主成分与部分元素正相关性,第1主成分PCA1与Co、V、Cu元素呈正相关(相关系数>0.9),第2主成分PCA2与Se、Ti元素呈正相关(相关系数>0.8),第3主成分PCA3与Pb元素呈正相关(相关系数>0.9),第4主成分PCA4与Cr元素呈正相关(相关系数>0.6),前4个主成分的累计方差贡献率为82.69%,超过总方差的80%,因此Co、V、Cu、Se、Ti、Pb、Cr这七种元素是橡胶籽的特征元素,是能显著影响橡胶籽中无机元素组成的主要综合指标。

表5 各主成分特征值、贡献率及累积贡献率

表6 主成分载荷矩阵

2.6 聚类分析

对18批橡胶籽样品中的16种无机元素含量采用组间联接方法、系统聚类分析法进行聚类分析,进一步简化分析数据。当欧式距离平方和为5 时,18个样品可被分为4大类,结果见图2。第1类:S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S11、S12、S14、S15;第2类:S9、S10、S13;第3类:S16、S17;第4类:S18。其中,第1类样品分别来自于广东、广西、海南和云南;第2类样品分别来自于海南和广西;第3类样品来自于福建,第4类样品来自于我国台湾,显示了一定的差异性。由此也可看出,不同的种植气候、土壤、地理空间造成了土壤中微量元素的差异性,也间接影响了作物的生长状况,从而导致植物吸收的元素组成不同[24]。

图2 橡胶籽聚类分析结果

3 结论

本实验建立了微波消解结合ICP-MS内标法同时测定橡胶籽中的Mg、K、Ca、Zn、Ti、Cu、Mn、Ni、Cr、Ba、Co、Cd、Se、Pb、V、As等16种无机元素的检测方法。采用内标补偿法,排除基体效应对多元素产生的抑制作用,最后,通过方法学验证了该方法的准确性和可靠性。表明该检测方法准确、可靠,适用于橡胶籽中多元素的测定。

采用建立的ICP-MS法测定6个不同产地橡胶籽中16种无机元素的含量,建立各产地橡胶籽中无机元素指纹图谱,通过主成分分析、聚类分析等方法对其元素分布规律进行研究。结果表明,不同产地橡胶籽中均含有丰富的Mg、K、Ca、Ti、Mn、Ni、Zn等无机元素,且各种元素含量存在较大差异。通过元素图谱可以看出,橡胶籽在元素含量分布和元素种类上整体趋势接近,其中有部分元素的不同产地相对含量存在一定差异,具有一定代表性。

以橡胶籽中15种无机元素含量进行主成分分析,前4个主成分(Co、V、Cu、Se、Ti、Pb、Cr)对总方差的累积贡献率达82.69%,能够代表橡胶籽中无机元素的整体特征信息,可初步认为Co、V、Cu、Se、Ti、Pb、Cr是影响橡胶籽无机元素组成的特征元素,值得进一步深入探讨。通过对18批橡胶籽样品中16种无机元素含量进行聚类分析,可将18个样品分为4大类,分属于不同的地域,表明橡胶籽无机元素的含量与环境、地域等因素具有相关性。

本研究结果可为橡胶籽资源的进一步开发利用提供更多可靠的数据支撑。