田 丽，梁国辉，廖志宏

慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）是由牙周病原菌群失衡所引起牙周组织的一种慢性炎症[1，2]，是一种乏氧性疾病。 乏氧环境在CP 发生中发挥着重要的作用[3~5]，其中乏氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是调节氧稳态高度特异性核转录因子，其基因突变与多种乏氧性疾病有关[3~7]，但与CP 发病的易感性未见报道， 且多态性分布存在地域性和种族性差异。 血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor，VEGF） 是HIF-1α 调节的一种主要下游靶基因[8]。 25-羟基维生素D[25-hydroxyvitamin D，25-（OH）VitD] 是骨代谢调节的一种重要激素，具有多种生物效应[9]。 为此，笔者对深圳地区CP 患者和健康人群HIF-1α、VEGF、25-（OH）VitD 水平与CP临床指标的相关性及HIF-1α 基因（hypoxia inducible factor-1α gene，HIF-1α）G1790A 位点多态性进行分析，探讨其在CP 发病中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 临床材料与仪器

1.1.1 临床材料

选择2020 年3 月至2022 年5 月CP 确诊者137例（CP 组），其中男性81 例，年龄16 ～58 岁，平均年龄31.89 岁（标准差15.67 岁）；女性56 例，年龄17 ～56 岁，平均年龄32.04 岁（标准差14.72 岁）；疾病程度，轻度79 例，中度31 例，重度27 例。 同期非CP 健康体检人群115 例（对照组），其中男性69 例，年龄15 ～57 岁，平均年龄30.28（标准差13.95 岁）；女性46 例，年龄16 ～59 岁，平均年龄32.86（标准差15.03岁）。 该研究对象及家属知情，并签定知晓同意书，同时已通过单位伦理委员会批准。

选择标准：①所有患者均符合《牙周病学》[10]中的诊断标准；②CP 初诊者，并根据牙周袋探诊深度、附着丧失（attachment loss，AL）及骨吸收程度分为轻度[牙龈有炎症和探诊出血，牙周袋深度（probing depth，PD）≤4 mm，1 ≤AL ＜3 mm，X 射线片显示牙槽骨吸收不超过根长的1/3，可有口腔异味]、中度（牙龈有炎症和探诊出血， 也可有脓，PD ≤6 mm，3 ≤AL ＜5 mm，根长1/3< 牙槽骨水平或角型吸收< 根长1/2， 牙齿可有轻度松动，多根牙根分叉区可有轻度病变）及重度（炎症较明显或发生牙周脓肿，PD>6 mm，AL ≥5 mm，牙槽骨吸收>根长1/2，多根牙有根分叉，多数牙齿有松动）；③AL ＞1 mm，牙槽骨有垂直或水平型吸收；④PD ＞3 mm，牙周袋伴有炎症，且探诊后出血；⑤自愿参与配合者。

排除标准：①近3 个月内服过抗生素、类固醇类及维生素D 等药物者；②有牙周基础治疗史者；③伴有高血压、 糖尿病及心脑血管等全身系统性疾病者；④伴有家族遗传史者；⑤有吸烟史者；⑥月经、妊娠及哺乳期者；⑦伴有肿瘤、血液性疾病者；⑦伴有其它乏氧性疾病者。

两组年龄、性别比例等临床资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.1.2 主要试剂与仪器

HIF-1α、VEGF 试剂盒（上海科顺， 中国）；DNA试剂盒（深圳亚能，中国）。

ABI7500 PCR 仪（ABI，美国）；AE275 酶免仪（深圳爱康， 中国）；C8000 化学发光分析仪及25-（OH）VitD 试剂盒（雅培，美国）。

1.2 方法

1.2.1 实验室检查

取静脉血2.0 ～3.0 mL，分离血清；采用酶联免疫吸附分析（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法检测HIF-1α 和VEGF 水平。

取静脉血2.0 ～3.0 mL，分离血清，采用C8000 化学发光分析仪对25-（OH）VitD 水平进行检测， 操作依规程进行。

1.2.2 聚合酶链式反应

DNA 提取： 取乙二胺四乙酸二钾（dipotassium ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA-K2）抗凝全血，采用DNA 提取盒提取全血组DNA，并将提取到符合实验要求的DNA 于-20 ℃冰柜内保存备用。

HIF-1α G1790A 位点多态性分析：运用限制性片段长度多态性-聚合酶链式反应法对HIF-1α G1790A位点多态性进行分析，具体操作参照文献[11]。

1.2.3 牙周临床指标检查

对CP 患者进行牙周检查，并记录PD、AL、出血指数（bleed index，BI）及菌斑指数（plague index，PLI）。

1.2.4 评价指标

包括HIF-1α、VEGF、25-（OH）VitD、HIF-1aG1790A位点多态性、PD、AL、BI 及PLI。

1.3 统计学方法

运用SPSS 23.0 软件进行统计分析。 以均值±标准差和率（%）分别表示计量和计数资料，运用t/χ2检验比较组间差异； 运用Hardy-Weinberg 检验遗传平衡。 P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清HIF-1α、VEGF 及25-（OH）VitD 水平比较

CP 组HIF-1α 和VEGF 水平明显高于对照组，而25-（OH）VitD 水平明显低于对照组， 差异有统计学意义（P<0.05）。 见表1。

表1 两组血清HIF-1α、VEGF 及25-（OH）VitD 水平比较Tab.1 Comparison of levels of HIF-1α,VEGF and 25-(OH)VitD between 2 groups

2.2 慢性牙周炎组不同病情程度患者HIF-1α、VEGF 及25-（OH）VitD 水平比较

HIF-1α 和VEGF 水平重度> 中度> 轻度，而25-（OH）VitD 水平重度< 中度< 轻度， 差异有统计学意义（P<0.05）。 见表2。

表2 CP 组不同病情程度患者HIF-1α、VEGF 及25-（OH）VitD 水平比较Tab.2 Comparison of HIF-1α,VEGF and 25-(OH)VitD levels in CP patients with different severity

2.3 慢性牙周炎组不同病情程度患者牙周临床指标比较

PD、AL、BI 及PLI 值重度> 中度> 轻度， 不同病情程度之间差异有统计学意义（P < 0.05）。 见表3。

表3 CP 组不同病情程度CP 患者牙周临床指标比较Tab.3 Comparison of periodontal clinical indexes of CP patients with different severity

2.4 慢性牙周炎组HIF-1α、VEGF 及25-（OH）VitD 水平与牙周临床指标的相关性

经Pearson 相关分析， 结果显示，CP 组HIF-1α、VEGF 水平与PD、BI、AL、PLI 呈正相关，而25-（OH）VitD 水平呈负相关（P ＜0.05）。 见表4。

表4 CP 组HIF-1α、VEGF 及25-（OH）VitD 水平与牙周临床指标的相关性Tab.4 Correlation between HIF-1α,VEGF and 25-(OH)VitD levels and periodontal clinical indexes in CP group

2.5 两组HIF-1α 基因G1790A 位点多态性

CP 组和对照组HIF-1αG1790A 位点均检出3 种基因型（GG、GA 和AA），经Hardy-Weinberg 检验，差异无统计学意义（χ2=1.3014，P>0.05）。取样具有代表性（图1）。

图1 HIF-1α G1790A 位点测序图Fig.1 Sequencing map of HIF-1α G1790A

与对照组对比，CP 组AA 基因型及A 等位基因频率明显升高，而GG 基因型及G 等位基因频率明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；但GA 基因型频率差异无统计学意义（P>0.05）。 见表5。

表5 两组HIF-1α G1790A 位点多态性比较Tab.5 Comparison of HIF-1α G1790A polymorphism between 2 groups

2.6 慢性牙周炎组不同病情程度患者HIF-1α G1790A 位点多态性

HIF-1α G1790A 位点基因型和等位基因频率在CP 组不同病情程度患者中差异无统计学意义 （P>0.05）。 见表6。

表6 不同病情程度CP 患者HIF-1α G1790A 位点多态性比较Tab.6 Comparison of HIF-1α G1790A polymorphism in CP patients with different severity

2.7 慢性牙周炎组不同基因型患者HIF-1α 水平比较

与GA 和GG 基因型患者HIF-1α 水平（24.03pg/mL和22.74 pg/mL）对比，AA 基因型（37.82 pg/mL）升高尤为突出，差异有统计学意义（t=4.2689、5.0261，P<0.05）； 但GA 和GG 基因型差异无统计学意义 （t=1.3025，P>0.05）。

3 讨论

CP 是由牙周病原菌群失衡引发牙周软、 硬组织的一种慢性炎症性的破坏性病变，常由菌斑性牙龈炎缓慢发展而成，可导致牙龈萎缩、牙槽骨吸收，甚至牙齿脱落，且CP 发病率高，约占牙周炎的95%，严重影响人身健康和生存质量[12，13]。 但CP 发病机制十分复杂，给CP 的预防带来一定困难。 因此，加强CP 患者发病机制研究对CP 诊断、病情评估及预防具有重要的意义。

有研究表明，慢性炎症可引起牙周组织微循环障碍及低血流灌注， 从而导致牙周组织乏氧微环境，而机体在乏氧环境下可通过多种生物学效应促进血管新生、改善细胞代谢及细胞活性调控相关分子表达等细胞氧合及存活率[14，15]。 HIF-1α 是介导炎症、肿瘤等多种乏氧性疾病的一种调节蛋白关键因子，与多种乏氧性疾病发生有关[16~18]。 VEGF 是一种能促进血管新生，并能维持血管完整性和通透性的特异性有丝分裂原，但最近研究表明，乏氧环境是血管生成的有利刺激，血管生成与乏氧有密切关系[19]。 25-（OH）VitD 通过调节维生素D（vitamin D，VitD）靶基因转录，调节成骨、破骨及软骨等细胞分化、增殖及免疫炎症反应，对宿主免疫调节和骨密度产生影响，与多种疾病的发生和进展有关[20，21]。 以上各指标单独检测在CP 中的作用目前已见报道，但联合检测及与牙周临床指标的相关性未见报道。 笔者研究结果显示，CP 患者HIF-1α、VEGF 水平明显升高，而25-（OH）VitD 水平明显降低，且不同病情严重程度之间差异有统计学意义（P<0.05）， 这除了可能与机体在乏氧微环境下细胞核大量产生和分泌HIF-1α，且HIF-1α 降解途径受阻于细胞核内并聚集，导致其水平增加，而HIF-1α 与HIF-1β 结合形成HIF-1， 转移至细胞核内， 并结合于VEGF 和VEGF 受体编码基因调控区低氧反应元件的结合点上，促进VEGF 水平增加，从而导致VEGF转录激活有关外， 还可能与25-（OH）VitD 水平降低导致其对机体免疫炎症及骨代谢调节能力减弱有关。结果还显示，牙周临床指标随着CP 患者病情加重而升高， 而HIF-1α、VEGF 及25-（OH）VitD 水平与CP临床指标密切相关，表明上述指标在CP 的发生和进程中发挥着重要的作用。

有研究表明，不同地区、不同人群对CP 的易感性可能存在很大差异， 这种差异主要由遗传决定，而多种遗传基因位点多态性与CP 发病有关[22]。 HIF-1由α 和β 亚基构成，其生理活性主要由α 亚基决定，而HIF-1α存在多个单核苷酸多态性 （single nucleotide polymorphism，SNP）位点，其中G1790A 位点是目前研究最多的位点之一， 与多种疾病发生有关[23，24]，但与CP 发病的相关性未见报道。 笔者研究结果显示，深圳地区CP 患者HIF-1α G1790A 位点基因突变呈SNP，以AA 基因型和A 等位基因频率升高尤为明显， 这表明HIF-1α G1790A 位点SNP 可能与深圳地区CP 发病有关。 同时携带AA 基因型CP 患者HIF-1α 水平明显高于其他基因型（P<0.05），但与病情严重程度无关 （P > 0.05）， 这可能与HIF-1α G1790A 位点SNP 通过影响其蛋白质水平、结构或生物学活性而在CP 发病中发挥作用的。

综上所述，CP 患者与健康人群HIF-1α、VEGF及25-（OH）VitD 水平存在很大差异， 且与牙周临床指标密切相关。 同时HIF-1α G1790A 位点基因突变呈SNP， 可能与深圳地区CP 发病存在一定易感性。因此， 加强HIF-1α、VEGF、25-（OH）VitD 水平及HIF-1α G1790A 位点SNP 分析，对CP 诊断、病情评估及发病机制研究具有重要意义。