车小红，张咏梅

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，占原发性肝癌的85%~90%。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染被认为是中国HCC 发展的主要危险因素[1~3]。HCC 的发展是一个复杂的多步骤过程，涉及持续的炎症损伤，包括肝细胞坏死和再生[4]。 尽管近年来在成像技术、肝移植、手术切除、射频消融（radiofrequency ablation，RFA）、经导管动脉化学栓塞治疗（transarterial chemoembolization，TACE） 和全身化学治疗等方面都取得了新的突破，但HCC 发病率高、预后差，晚期肝癌患者的治疗选择非常有限，预后率仍然很低，至今没有有效的治疗方法[5]。 目前，HCC 的5 年生存率不超过20%，早期诊断可显著降低HCC 患者的死亡率[6]。 因此，提高HCC 的早期诊断率和探索HCC 形成的具体机制是提高HCC 总生存率的主要方法。

外泌体 （exosomes，Exos） 是直径为50~100 nm细胞外囊泡， 它们含有细胞分泌的许多活性成分，包括脂质、蛋白质、RNA 和DNA[7]。 Exos 通过调节肿瘤细胞之间及肿瘤细胞与非肿瘤细胞之间的信号转导，间接影响肿瘤微环境，是肿瘤发生的重要工具[8]。细胞类型如间充质细胞、免疫细胞和肿瘤细胞可诱导Exos 的释放，这表明Exos 参与了肿瘤的发生、发展、转移、免疫逃逸和耐药[9]。此外，肿瘤来源的Exos 含有大量与癌症相关的血清学标志物，如miRNAs，可用于早期HCC 的检测[10，11]。 多项研究表明外泌体与HCC的发生、发展密切相关，对Exos 的深入研究，可能有助于解释肿瘤的形成和转移过程， 为HCC 的早期诊断和治疗提供新的方法。笔者通过提取并鉴定小鼠肝癌细胞Hepa1-6 来源的Exos（Hepa1-6 Exos），研究AML12 细胞摄取Hepa1-6 Exos 的效率，并探讨Hepa1-6 Exos 对AML12 细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

Hepa1-6 细胞和AML12 细胞（中国科学院细胞库）；溶酶体膜糖蛋白（CD63）、肿瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）、 白蛋白（albumin，ALB）和α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，A1AT）抗体（Abcam 公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

小鼠肝癌细胞Hepa1-6 和小鼠正常肝细胞AML12在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的达氏修正伊氏培养液（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM） 中培养。 细胞每隔1 d 更换新鲜培养液，在37 ℃、体积分数5%CO2培养液中生长。

1.2.2 外泌体提取

Hepa1-6 细胞在无胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）培养液中培养24~36 h 后，采用ExoquickTC试剂盒提取Exos。 取上清液500 g 离心10 min 去除细胞，然后在10 000 g 条件下离心20 min，清除残留的细胞碎片。所得上清液经0.4 μm 过滤器过滤后，采用ExoquickTC试剂盒沉淀。 所得样品在磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS） 或DMEM 中重悬，保存在-80°C 条件下。

1.2.3 外泌体鉴定

采用电子显微镜分析Hepa1-6 Exos 的形态。 将纯化的Exos 添加到网格中，用2%醋酸铀酰将Hepa1-6 Exos 染色，于电子显微镜（型号：Tecnai G2 Spirit BioTwin）成像拍片。 分析Hepa1-6 Exos 的粒径分布，将提取的Hepa1-6 Exos 均匀稀释到500 ng/mL（蛋白质质量浓度），采用Nanoplus 分析仪（型号：ZetaVIEW S/N 17-310）检测Hepa1-6 Exos 粒径。

1.2.4 Western blot

使用放射免疫沉淀试验（radioimmunoprecipitation assay，RIPA） 裂解缓冲溶液在4 ℃条件下提取细胞或Hepa1-6 Exos 中的总蛋白， 用Pierce BCA 蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。蛋白质浓缩在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）（6 %）上，用SDS-PAGE（12%）分离。 将凝胶转移到硝化纤维素过滤膜上，进行印迹分析。 用3%牛血清ALB 阻断后，膜随后与一抗孵育。 在Tris 缓冲溶液加吐温-20（Tris-buffered saling and tween-20，TBST）中洗涤3次后，与辣根过氧化物酶偶联二抗室温孵育1 h。

二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量实验步骤制备BCA 工作液，按A ∶B=50 ∶1 比例配置工作液，充分混匀；将蛋白质样品加入到各孔中，每孔分别加入BCA 工作液；密封后，于37 ℃静置30 min；室温，用酶标仪检测光密度（optical density，OD）562nm值；制作标准曲线，计算蛋白样品浓度。

1.2.5 外泌体的体外荧光示踪

将纯化的Hepa1-6 Exos （1 μg/μL） 与1 mmol/L的DiI（细胞膜橙红色荧光探针）染料（500 ∶1 体积比）孵育30 min， 用PBS 洗涤后离心去除游离的荧光染料。为了在AML12 细胞中体外示踪Hepa1-6 Exos，将AML12 细胞与标记的Hepa1-6 Exos 孵育3 h，用PBS洗涤3 次，再用4%多聚甲醛溶液固定10 h 后，再用PBS 洗涤2 次，10 min 后再用PBS 洗涤2 次。 细胞核用Hoechst（1 ∶1 000）在37 ℃反染10 min。 实验结束时，用醋酸钠溶液清洗细胞（去除非特异性黏附），并使用共聚焦显微镜观察拍片。

1.2.6 细胞增殖毒性检测

实验分成2 组：对照组（AML12 细胞）和实验组（AML12 细胞+Hepa1-6 Exos）。 将2 组细胞接种至96 孔板，每孔加入1×103个细胞，培养12 h 后，对2组细胞进行处理。 24 h、48 h、72 h 后进行CCK-8 检测，在450 nm 波长测定OD[12]。

1.2.7 细胞凋亡检测

实验分组同1.2.6 所述， 将2 组细胞接种至6 孔板，每孔加入2×105个细胞，培养12 h 后，对2 组细胞进行处理。24 h、48 h、72 h 后用流式细胞仪进行检测。

1.2.8 聚合酶链式反应

使用TRIzol 试剂按制造商说明书指示从2 组细胞中提取总RNA。 然后， 利用PrimeScript 第一链cDNA 合成试剂盒将RNA 反转录为cDNA，用Prime-Script RT master mix 分析mRNA 水平上的相关基因表达。 所有定量聚合酶链式反应 （quantitative polymerase chain reaction，qPCR）至少重复3 次。

甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参。 ALB 上游引物序列为5′-TGCTTTTTCCAGGGGTGTGTT-3′， 下游引物序列为5′-TTACTTCCTGCACTAATTTGGCA-3′；A1AT 上游引物序列为5′-AGGGTGGCTTCTAGCCTCTTT-3′， 下游引物序列为5′-CAGTCCGTGTGTACTCTTCCC-3′；GAPDH 上游引物序列为5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物序列为5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

RNA 定量： 定量时适量稀释溶于焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）的RNA 样品，紫外分光光度计选择RNA 定量， 检测样品， 读取OD260nm及OD260nm/OD280nm比值。

1.3 统计学方法

利用GraphPad Prism 7.0 进行统计学分析。 数据用平均值± 标准差表示。 两组间比较采用Studentdent’s t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。 P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外泌体鉴定

2.1.1 外泌体形态

相关研究报道Exos 为脂质双分子层结构。 实验首先收集了Hepa1-6 Exos，通过透射电子显微镜分析其形态。 结果显示Hepa1-6 Exos 呈脂质双层茶托样结构，具有典型的Exos 结构，结果符合Exos 的形态特征（图1）。

图1 Hepa1-6 Exos 的形态特征（标尺=100 nm）Fig.1 Image of morphological characteristics of Hepa1-6 Exos(scale bar=100 nm)

2.1.2 外泌体特异性蛋白表达

Exos 表达特异性蛋白CD63、TSG101 和CD9 等，而不表达高尔基体标志物GM130 蛋白。 Western blot实验结果表明，Hepa1-6 细胞和Hepa1-6 Exos 均表达CD9、CD63 和TSG101 蛋白（图2），证明Hepa1-6 Exos 表达标志性蛋白。

图2 Hepa1-6 Exos 特异性蛋白表达Fig.2 Diagram of Hepa1-6 Exos specific protein expression

2.1.3 外泌体粒径分析性

对提取Hepa1-6 Exos 并进行粒径分析，结果显示，Hepa1-6 Exos 粒径主要分布在50~200 nm，且基本呈正态分布（图3）。 符合Exos 正常粒径大小分布范围。

图3 Hepa1-6 Exos 粒径分析Fig.3 Diagram of particle size analysis of Hepa1-6 Exos

2.2 AML12 细胞高效摄取Hepa1-6 Exos

免疫荧光显示，Hepa1-6 Exos 进入AML12 后，主要定位于细胞质中，且被细胞高效摄取（图4）。 说明Hepa1-6 Exos 能与AML12 细胞进行充分信息交流。

图4 AML12 细胞摄取Hepa1-6 Exos 情况（标尺=5 μm）Fig.4 Images uptake of Hepa1-6 Exos by AML12 cells(scale bar=5 μm)

2.3 Hepa1-6 Exos 促进AML12 细胞增殖及抑制其凋亡

将Hepa1-6 Exos 与AML12 细胞共培养24 h、48 h、72 h，CCK-8 实验表明，与对照组相比，实验组细胞的增殖能力得到提高（表1）。 说明Hepa1-6 Exos可促进AML12 细胞增殖。 流式细胞技术检测细胞凋亡，与对照组相比，实验组细胞凋亡率下降（表2）。 上述结果表明Hepa1-6 Exos 能抑制AML12 细胞的凋亡，且其抑制作用较大。

表1 两组AML12 细胞增殖率比较Tab.1 Comparison of proliferation rate of AML12 cells between 2 groups

表2 两组AML12 细胞凋亡率比较Tab. 2 Comparison of apoptosis rate of AML12 cells between 2 groups

2.4 Hepa1-6 Exos 增强AML12 细胞ALB mRNA和A1AT mRNA 的表达

经Hepa1-6 Exos 处理后，采用qPCR 和Western blot 检测两组细胞中ALB mRNA、A1AT mRNA 和其蛋白的表达情况。实验组ALB mRNA、A1AT mRNA 相对表达量分别为4.46±0.50、6.89±1.01，对照组分别为1.00±0.21、1.00±0.35。 与对照组相比， 实验组ALB mRNA、A1AT mRNA 表达水平明显升高，差异有统计学意义（t=3.96、5.27，P<0.05）。 见图5。

图5 两组AML12 细胞表达ALB、A1AT 蛋白电泳图（Western blot）Fig. 5 Electrophoretogram of AML12 cells expressed ALB and A1AT protein(Western blot)

3 讨论

HCC 是一种致命恶性肿瘤， 具有较高的复发风险，其转移受微环境因素的影响较大，迄今肝癌早期诊断仍然缺乏合适的标志物[13]。目前，肝移植、介入放射治疗和化学栓塞治疗仍是治疗不可切除肝癌的主要选择。 Exos 是具有脂质双层膜结构的细胞外小泡，1989 年由Johnstone RM 在研究网织细胞时首次发现[14]。 Exos 是具有多种生物功能的纳米级颗粒，广泛分布于血液、唾液、牛奶、腹水、尿液等体液中，富含核酸、蛋白质、脂类和无机盐离子[15]。Exos 参与细胞之间或细胞与组织之间重要的信息和物质的交换。它们维持着人体细胞发育、生长、分化和衰老的关键生理过程，是人类生命所必需的[7]。 越来越多的研究表明，Exos 的分泌和功能异常在恶性肿瘤的发生、 发展和治疗中起着至关重要的作用。

肿瘤来源的Exos 在侵袭转移过程的几乎所有步骤中都起着至关重要的作用。首先，肿瘤源性Exos 提供自分泌和旁分泌信号， 激活肿瘤上皮细胞中的上皮-间质转化 （epithelial- mesenchymal transition，EMT），使肿瘤细胞具有侵袭周围组织的能力。 其次，肿瘤Exos 被吸收并沉淀到目标组织中， 在转移细胞停止之前形成一个转移前小生境。最后，肿瘤Exos 调节宿主免疫，使疾病无限制地发展，甚至通过激活炎症反应途径逃避免疫细胞，使其得到培养[16，17]。 近年来，肿瘤来源的Exos 已被证实能促进癌症进展。

相关研究表明，通过Exos 的RNA 和蛋白质交换不仅在HCC 的发生发展中具有关键作用， 而且可能是潜在的实时、非侵入性生物标志物和治疗靶点的来源[18]。迄今为止，对肝脏Exos 的研究有限，大多数研究来源于细胞学实验。 既往研究表明，Exos 作为肿瘤微环境中的载体，在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，也是HCC 诊断和预后潜在有效的生物标志物[19，20]。肝癌Exos 分泌的miRNA 可诱导多种生物学功能，通过灭活致癌miRNA 可能是肝癌靶向治疗的新方向。 尽管Exos 和HCC 研究进展令人振奋，但仍有许多问题有待进一步阐明， 如Exos 在HCC 转移的EMT 途径中的作用，以及Exos 在HCC 与靶细胞之间的作用机制等仍有待进一步研究。

笔者通过高速离心法提取Hepa1-6 Exos，保证了实验所需Exos 的纯度。 实验鉴定了Hepa1-6 Exos 的生物特征，其呈脂质双层茶托样结构，表达特征性蛋白， 粒径主要分布在50 ~ 200 nm。 上述结果表明Hepa1-6 Exos 具有Exos 的特征，符合其特性。实验揭示AML12 细胞能高效摄取Hepa1-6 Exos， 表明提取的Hepa1-6 Exos 能与AML12 细胞进行充分信息交流。 在此基础上，将Hepa1-6 Exos 与AML12 细胞共培养， 发现Hepa1-6 Exos 能促进AML12 细胞增殖，并抑制其凋亡；同时Hepa1-6 Exos 增强了AML12 细胞中ALB 和A1AT 的表达。 Exos 作为一种纳米级囊泡，具备克服各种生物屏障的能力。 它通过细胞膜融合、胞饮和内吞等方式进入细胞后，将自身携带的配体或受体、蛋白质或核酸，或作为药物递送载体对细胞发挥作用，影响细胞生长、分裂和迁移等生物学行为，从而改变受体细胞的生理和代谢功能。 Exos 通过膜融合将来源细胞的基因突变信息递送至受体细胞，从而导致原癌基因的激活和抗凋亡基因的表达，使肿瘤细胞获得增殖特性。 在伤口愈合后期，Exos 可抑制胶原蛋白表达，减少瘢痕形成。 研究发现，Exos 介导核酸、蛋白质和脂类等生物活性物质的递送参与肝癌的生长、转移和血管生成。

综上所述，笔者鉴定了肝癌细胞来源的Exos，并分析了其对正常肝细胞的影响， 结果表明Hepa1-6 Exos 可能与肝癌的发生发展相关。 因此Exos 有望成为肝癌诊断标志物，为肝癌早期诊断和治疗提供了新思路。 同时，笔者研究尚存在不足，肝癌细胞的Exos对正常肝细胞促增殖和抑制凋亡的机制还有待进一步研究，仍需体内实验阐明此作用机制，从而为肝癌的临床诊治提供新的策略。