宋鹏媛，刘丽娜，慈丽娜，王 卓，付赵虎，张鸿瑞

乳腺癌（breast cancer）是一种发病率和致死率均极高的恶性肿瘤，是导致全球女性癌症相关死亡的主要原因之一，且其发病率仍在不断增长[1，2]。 现已有大量研究证实，血管生成对肿瘤侵袭、转移过程有着重要的影响。传统的抗血管生成治疗对乳腺癌的治疗效果已十分确切，但其疗效始终较差。有文献显示[3，4]，部分患者在病程早期， 肿瘤大小未超过临床体积时，已出现远处转移， 甚至抗血管治疗促进了肿瘤的进展。这表明除肿瘤血管生成以外，可能有其他途径为肿瘤细胞的增殖生长提供了养分。血管生成拟态（vascular mimicry，VM）是一种新的肿瘤血液运输途径，主要由肿瘤细胞包围而成。肿瘤细胞通过分泌细胞外基质成分和自身塑形来围成管道结构，在恶性程度高和易发生转移的肿瘤细胞中普遍存在VM[5]。有文献指出[6~8]，在卵巢癌、骨肉瘤、肺癌等恶性肿瘤中存在VM，且存在VM 的恶性肿瘤患者的预后均较差，生存率普遍偏低。 VM 有望成为治疗恶性肿瘤的新靶点，但其具体形成机制尚未明确。Ki-67 是一种增殖细胞核相关抗原， 其功能与细胞的增殖过程密切相关，Ki-67 的表达水平越高，表明癌细胞增殖活跃度越高，侵袭和转移能力也越强[9]。 Ki-67 可特异性地反映肿瘤细胞的增殖指数。目前关于超声造影评估乳腺癌患者VM 的可行性及VM 与Ki-67 增殖指数的关系分析研究较少，笔者研究以186 例乳腺癌患者作为研究对象探讨其超声图像特征，便于辅助临床鉴别乳腺癌。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2018 年3 月至2020 年3 月在邢台市第三医院收治的经手术病理诊断为乳腺癌患者186 例，均为女性，年龄30 ～67 岁，平均年龄54.38 岁（标准差10.47 岁）；肿瘤直径1.3 ～4.3 cm，平均直径2.87 cm（标准差1.54 cm）；肿瘤临床分期，Ⅰ期51 例，Ⅱ期69 例， Ⅲ期29 例， Ⅳ期37 例； 腋窝淋巴结转移87例，无转移99 例。均于术前完善常规超声和超声造影检查，术后标本行病理检查。 所有患者均行改良根治术，临床资料完整。 所有患者及其家属均知晓该研究方案且签署同意书，经医院伦理委员会已批准该方案实施。

选择标准： ①均经病理学明确诊断为乳腺癌患者，且均为单病灶；②均接受改良根治术治疗；③术前均完善常规超声和超声造影检查；④超声检查前均无化学治疗、放射治疗及内分泌治疗史，未行空心针活检；⑤临床资料完整，且依从性较好。

排除标准：①合并心肝肾功能不全者；②造血功能存在障碍者；③对造影剂过敏者；④合并乳腺癌远处转移，或其他部位原发灶者；⑤双侧乳腺病灶或一侧乳腺多病灶者。

1.2 方法

1.2.1 超声检查

检测仪器选用系统自带软件超声造影匹配成像技术的意大利百胜MyLab Class C 彩色多普勒超声诊断仪，探头为LA 522E 变频线针探头，调节频率为3 ～13 MHz；先注入0.5 mL 0.9%氯化钠溶液（生理盐水）进行“水化”处理，而后注入造影剂，取患者仰卧姿势，解开衣衫，暴露双侧乳房，应用常规超声模式观察并记录其灰阶和血流图像特征，可根据血流分布情况选定病灶最佳切面。固定探头，并调整为超声造影模式，设置造影参数， 将配置完成的4.8 mL 造影剂混悬液经肘静脉注入患者体内，以0.9 %氯化钠溶液（生理盐水）进行冲管，并将造影全过程记录存盘。

1.2.2 图像分析

参照文献[10]中超声造影观察指标，观察实时动态造影图像达峰时整个病灶内造影剂的分布情况，如造影剂分布均匀性、 有无穿通支血管、 增强强度、范围、形式、形态及模式等。所有图像分析均由超声造影经验＞3 年的医师进行，并由另1 名相同资历的医师对结果进行再次核实，取2 名医师的共同意见。

1.2.3 术后病理检查

1.2.3.1 苏木精-伊红染色和CD34-高碘酸-希夫反应双染色 （1）苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色法：以4%甲醛溶液固定标本后，行石蜡包埋、切片、HE 染色。 待水化后，以苏木精染核、碳酸锂液返蓝处理。 所有操作均参照试剂盒说明书执行，置于光学显微镜下进行观察。

（2）CD34-高碘酸-希夫反应双染色：组织切片二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色完全后，终止显色反应，将切片置于过碘酸溶液中进行氧化反应（室温条件下）5 min，蒸馏水漂洗3 次，而后将Schiff液滴加至组织块上进行避光反应，15 min 后， 以苏木精衬染、分化液分化、树胶封片，完成所有染色步骤。

1.2.3.2 免疫组织化学染色 石蜡切片脱蜡至水化，根据SP 法执行操作， 将Ki-67、CD34 第一抗体分别滴加至不同载玻片同一个组织块的切片上，4 ℃条件下孵育过夜， 室温下孵育相应的抗体15 min， 而后DAB 显色、苏木精复染，中性树胶封片，观察Ki-67阳性表达情况。

1.2.3.3 判定标准 VM 阳性判定标准：CD34 染色结果呈阴性的肿瘤细胞构成含有血细胞的管腔，且其高碘酸-希夫反应染色结果为阳性。

Ki-67 阳性判定标准：细胞核呈棕黄色，判断标准参照文献[11]。 根据阳性细胞占比进行评分，占比不高于4%为0 分； 占比5%～25 %为1 分； 占比26%～50%记为2 分； 占比51%～75%记为3 分；占比不低于76%记为4 分。 而后根据染色强度进行评分。 0 分：未着色；1 分：黄色；2 分：棕黄色；3 分：棕褐色。每个标本的表达强度根据两项评分乘积进行分级：1 级为阴性（-）；2 级为弱阳性（+）；3 级为中度阳性（++）；4 级为强阳性（+++）；低于3 分记为低表达；≥4 分记为高表达。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0 进行数据分析。计数资料以例（%）表示， 行χ2检验。 预测评估价值采用受试者工作特性（receiver operating characteristic，ROC）曲线。P ＜0.05为差异有统计学意义，P ＜0.01 为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌VM 阳性及阴性患者临床病理特征比较

186 例乳腺癌患者， 其中VM 阳性患者48 例（25.81%）。肿瘤平均直径为（2.87±1.54）cm。根据患者的VM 诊断结果将其分为VM 阳性组 （n=48）和VM 阴性组（n=138），两组肿瘤直径、临床分期及腋窝淋巴结转移等临床病理特征对比，差异有显著统计学意义（χ2=31.908、31.213、15.042，P ＜0.01）。 见表1。

表1 乳腺癌VM 阳性组与VM 阴性组患者临床病理特征比较Tab.1 Comparison of clinical pathological characteristics between 2 groups

2.2 超声影像表现

2.2.1 常规超声表现

常规超声显示病灶多呈低回声， 形态不规整，边界不清晰（90.32%，168/186），其中31 例患者肿块内部可见钙化灶，呈斑片状或点状。 156 例患者肿块内部及其周边可见丰富彩色血流信号，且可见穿通支。

2.2.2 VM 阳性组与VM 阴性组患者超声造影特征比较

VM 阳性组患者的超声造影特征为不规整形态、不清晰边界及快进快退和快进慢退增强模式；VM 阴性组患者的超声造影特征为形态规整、 边界清晰，以及慢进慢退和慢进快退增强模式。 两组间增强形态、增强边界、增强模式对比，差异有显著统计意义（χ2=38.041、52.926、32.534，P ＜0.01）。 两组造影均匀性、增强强度等超声造影特征对比， 差异无统计学意义（P ＞0.05）。 见表2 和图1、2。

图1 VM 阳性组超声造影图和病理图Fig.1 Images of contrast-enhanced ultrasound and pathological in VM-positive group

图2 VM 阴性组超声造影图和病理图Fig.2 Images of contrast-enhanced ultrasound and pathological in VM-negative group

表2 VM 阳性组与VM 阴性组患者超声造影特征比较例（%）Tab.2 Comparison of contrast-enhanced ultrasound features between 2 groupscases（%）

2.3 超声造影特征鉴别诊断VM 阳性的ROC 曲线分析

ROC 曲线分析结果显示， 超声造影增强形态、增强边界、 增强模式诊断VM 阳性的ROC 曲线下面积（area under curve，AUC）分别为0.746、0.778、0.682， 其中增强边界的诊断价值最高， 准确度为86.2%，灵敏度为69.4%，特异度为91.5%。见图3、表3。

图3 超声造影特征鉴别诊断VM 阳性的ROC 曲线Fig. 3 ROC curve of contrast-enhanced ultrasound features in differential diagnosis of VM-positive

表3 超声造影特征鉴别诊断VM 阳性的诊断效能Tab.3 Diagnostic efficacy of contrast-enhanced ultrasound features in differential diagnosis of VM-positive

2.4 乳腺癌病理组织中Ki-67 的表达情况与VM表达的相关性

Ki-67 的免疫组织化学染色结果示，Ki-67 高度表达，表达率为70.97%（132/186）。 Ki-67 高表达组中VM 阳性率为43.94%（58/132）， 较Ki-67 低表达组VM 阳性率20.37%（11/54）明显偏高（χ2=9.123，P ＜0.05）。 见图4。

图4 VM 阳性组与VM 阴性组病理组织中Ki-67 的表达病理图Fig.4 Images of Ki-67 expression in pathological tissues of VM-positive group and VM-negative group

3 讨论

新生血管的生成是肿瘤细胞增殖生长的关键所在，当肿瘤直径达2 ～3 cm 时，为满足肿瘤的生长所需，肿瘤血管的生长速度会显著加快。 内皮依赖性血管、马赛克血管及VM 是目前已知的3 种恶性肿瘤血管供应模式。 其中VM 是一种新发现的肿瘤血管模式，其形成无需依赖血管内皮细胞，而是由高侵袭性肿瘤细胞经自身变形后围成[12，13]。 此种由肿瘤细胞围成的管状结构与真正的血管功能十分相似，在管腔型乳腺癌、前列腺癌及卵巢癌等多种恶性肿瘤中均已发现VM 的存在。 VM 可使得肿瘤细胞不受血管内皮细胞屏障作用的影响， 与血液直接接触进而发生转移[14]。现阶段临床上针对VM 的检测大多局限于大体病理切片和分子影像实验，超声造影表现评估乳腺癌患者VM 的可行性仍有待进一步探讨。 超声造影可辅助临床了解肿瘤病变病灶内部的微循环灌注情况，便于诊断肿瘤性疾病[15，16]。

笔者研究186 例乳腺癌中48 例VM 阳性患者，VM 阳性率为25.81%。 对比VM 阳性组和VM 阴性组的临床病理特征，结果显示，两组患者的肿瘤直径、临床分期及腋窝淋巴结转移情况差异显著，其中VM阳性组肿瘤直径＞2 cm，合并腋窝淋巴结转移及临床分期较晚的患者人数明显多于VM 阴性组， 这表明VM 具有较高的侵袭性。

笔者研究通过超声造影表现来评估乳腺癌患者的VM 表达情况， 结果显示，VM 阳性组患者的超声造影特征与VM 阴性组间差异存在显著统计学意义，增强模式明显不同。分析其原因可能是因为肿瘤中心和肿瘤边缘地带的VM 较多， 加上VM 结构多不规则，彼此链接构成环状网络通路，并活跃度较高，故在形态上呈现为形状不规则、边界不清晰[17，18]。此外，VM呈阳性的肿瘤可能会使得乳腺癌细胞的侵袭性增强。但笔者研究中VM 阳性病灶超声造影结果中，未见病灶扩大或内部充盈缺损，这可能与VM 具有一定的血液运行功能，可保障血液供应，进而未导致缺血坏死的发生。 此外，VM 主要是对肿瘤细胞的血液运行转移有促进作用，并非是促进其周边浸润，因此也未见其周边出现边缘扩大的情况。

笔者研究通过绘制ROC 曲线对各因素鉴别VM阳性的诊断效能进行了分析，结果显示，超声造影增强形态、 增强边界及增强模式诊断VM 阳性的ROC AUC 分别为0.746、0.778 和0.682， 其中增强边界的诊断价值最高，准确度为86.2%，灵敏度为69.4%，特异度为91.5%。这表明VM 形成的不规则管道样结构可影响肿瘤的形态，即可导致肿瘤细胞形态倾向不规整，边界模糊；且VM 的形成对肿瘤细胞增殖生长具有显著的促进作用，使其侵袭性明显增强，在超声造影图像中便表现为快进快退模式。 由此可见，超声造影表现评估乳腺癌患者VM 的可行性较高。

Ki-67 是一种与细胞增殖和复制密切相关的增殖细胞核蛋白抗原，其表达浓度与细胞周期的变化相关。 Ki-67 是反映肿瘤增殖活力的敏感指标，其表达水平与恶性肿瘤的发生、 发展及分化过程均显著相关。 刘月平[19]指出，乳腺癌患者肿瘤组织中的Ki-67与病情发展呈正相关。 任爱雄等[20]研究也得出了相似的结论。 崔刚等[21]指出，Ki-67 与血管内皮生长因子、Flt-1 等指标无明显相关性。 与VM 相似，Ki-67 也可促进肿瘤侵袭、转移、浸润，加速肿瘤进展，降低传统抗肿瘤血管治疗效果。 笔者研究结果显示，Ki-67 高表达组中VM 的阳性率较低表达组显著偏高。这表明Ki-67 与VM 两者可能对肿瘤细胞的浸润、转移过程具有协同促进的作用，有望成为辅助临床诊断乳腺癌的参考指标。

综上所述，VM 和Ki-67 在乳腺癌患者中均高度表达， 且两者的表达水平存在一定的联系，Ki-67 可能参与了VM 的生成过程；超声造影表现对乳腺癌患者VM 的诊断价值较高， 可辅助临床鉴别VM 阳性者。 但笔者研究还存在较大局限性，一方面笔者研究的样本量较小， 研究结论仍需扩大化试验验证准确度；另一方面未能深入探讨Ki-67 是否参与VM 的生成过程及具体参与机制，未来将针对以上问题，展开更深入研究。