刘嘉璇，陈月星，2，黄金辉，李立丹

（1.商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000；2.陕西省秦岭特色生物资源产业技术研究院，陕西 商洛 726000；3.商洛市烟草公司洛南分公司，陕西 商洛 726000；4.商洛市烟草公司，陕西 商洛 726000）

烟草（Nicotiana tabacumL.） 属于茄科烟草属，一年生或有限多年生草本植物，是我国重要的经济作物之一，广泛分布于云南、湖南、陕西、河南等地[1]。每年烟草叶片被采集后，产生大量的秸秆未得到有效利用，一般情况下，烟草秸秆被堆弃田间或直接焚烧，不仅污染空气，而且造成资源的严重浪费[2-4]。木聚糖（C5H8O4） 是一种存在于植物细胞壁中的异质多糖，是除了纤维素以外植物体中含量最丰富的天然多糖，占植物细胞干质量的15%～35%[5-6]。木聚糖具有增强免疫力、抗氧化等多种生理功能[7-10]，被广泛应用于化工、保健等领域。基于此，拟以烟草秸秆为原料，采用碱法提取烟草秸秆中的木聚糖，并进一步应用响应面法对提取工艺进行优化，为烟草秸秆的再利用提供一定的研究思路和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

材料：烟草秸秆，陕西省商洛市烟草公司提供。

试剂：木聚糖标准品、盐酸、氢氧化钠、3,5-二硝基水杨酸、苯酚、浓硫酸等试剂均为分析纯。

仪器：SI-234 型电子天平，北京有限公司产品；YB-500A 型粉碎机，永康市速锋工贸有限公司产品；HH-4 型数显恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司产品；R-501 型旋转蒸发器，上海一科仪器有限公司产品；7225B 型紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司产品；DZF-6020 型真空干燥箱，上海博迅实业有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 原料预处理

将烟草秸秆洗净干燥（45 ℃） 后粉碎，称取一定量干燥的烟草秸秆粉末并在65 ℃条件下进行脱脂（氯仿∶甲醇= 1∶1），过滤弃去滤液，将脱脂后的粉末在105 ℃条件下烘干备用。

1.2.2 木聚糖的提取

称取一定量的脱脂烟草秸秆粉末，用不同浓度的氢氧化钠溶液浸提不同时间，真空抽滤，调节滤液的pH 值至5.0 左右，真空浓缩，加入4 倍体积的95%乙醇进行醇沉（4 ℃冰箱储存过夜），将样液以转速4 000 r/min 离心15 min 得到沉淀并烘干，得到粗木聚糖[7-8]。

1.2.3 木聚糖标准曲线

准确称取10 mg 木聚糖标准品至10 mL 容量瓶中，配制质量浓度为1 mg/mL 的标准木聚糖溶液，分别吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 置于20 mL试管中，加入蒸馏水2 mL，然后加入3,5 - 二硝基水杨酸（DNS） 溶液3 mL，在沸水浴中显色5 min，然后在冷水中冷却至室温，加蒸馏水至刻度线，振荡混匀后于波长540 nm 处测吸光度，以吸光度为纵坐标，木聚糖质量浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.2.4 木聚糖含量的测定

称取干燥后的木聚糖粗品，加入适量的质量分数为8%的H2SO4溶液，于100 ℃下水解2 h，用浓度为2 mol/L 的氢氧化钠溶液中和过滤，定容至100 mL，采用DNS 法测还原糖含量。木聚糖提取率的计算方法如下：

式中：C——木聚糖测定的质量浓度，mg/mL；

N——稀释倍数；

0.9 ——木聚糖聚合系数；

m——原料的质量，g。

1.2.5 单因素试验

控制其他条件一样，分别研究氢氧化钠质量浓度（0.05，0.10，0.15，0.20，0.25），提取温度（40，50，60，70，80 ℃），料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1 ∶25，1 ∶30），提取时间（3.0，3.5，4.0，4.5，5.0 h），对烟草秸秆木聚糖提取率的影响，在相同条件下用紫外可见分光光度计检测待测液的吸光度，数据分析得到木聚糖的提取率[9-11]。

1.2.6 响应面试验

基于单因素试验，根据Box-behnken 中心组合试验设计原理，设置4 个自变量，以木聚糖的提取率Y为响应值，设计四因素三水平的响应面分析试验，重复5 次中心试验[12]。

1.2.7 最佳工艺验证试验

精确称取烟草秸秆2.00 g（平行3 份），根据响应面分析软件所得最佳工艺条件提取烟草秸秆的木聚糖含量，计算提取率，验证该工艺的准确性。

2 结果与分析

2.1 木糖标准曲线

根据1.2.3 的方法，测出不同质量浓度的木聚糖的吸光度A，用Excel 表格作线性回归，得出标准曲线的线性方程Y=10.54X+0.066，相关系数R2=0.998 2，在0.01～0.05 mg/mL 范围内木糖质量浓度和吸光度有良好线性关系。

木糖标准曲线见图1。

图1 木糖标准曲线

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取时间对烟草秸秆木聚糖提取率的影响

在氢氧化钠质量浓度为0.20 g/mL，提取温度为60 ℃，料液比1∶15 的条件下探究烟草秸秆提取率与提取时间的关系。结果表明，随着提取时间的延长，烟草秸秆木聚糖提取率呈现先升高后降低的趋势，而提取时间为4.5 h 时提取率最高，因此提取的最佳时间为4.5 h。

提取时间对烟草秸秆木聚糖提取率的影响见图2。

图2 提取时间对烟草秸秆木聚糖提取率的影响

2.2.2 氢氧化钠质量浓度对烟草秸秆木聚糖提取率的影响

在提取时间4.5 h，提取温度60 ℃，料液比1∶15 的条件下，探究烟草秸秆木聚糖提取率与氢氧化钠质量浓度的关系。结果表明，随着氢氧化钠质量浓度的增加，烟草秸秆木聚糖提取率先增大后逐渐减少，当NaOH 质量浓度为0.2 g/mL 时提取率最高。

氢氧化钠质量浓度对烟草秸秆木聚糖提取率的影响见图3。

图3 氢氧化钠质量浓度对烟草秸秆木聚糖提取率的影响

2.2.3 提取温度对烟草秸秆木聚糖提取率的影响

控制条件料液比1∶15，氢氧化钠质量浓度0.20 g/mL，提取时间4.5 h，探究烟草秸秆木聚糖提取率与提取温度的关系。结果表明，烟草秸秆木聚糖提取率随着温度的升高在上升，在70 ℃提取率达到25.12%；温度继续升高，烟草秸秆木聚糖提取率上升不大。

提取温度对烟草秸秆木聚糖提取率的影响见图4。

图4 提取温度对烟草秸秆木聚糖提取率的影响

2.2.4 料液比对烟草秸秆木聚糖提取率的影响

在氢氧化钠质量浓度为0.20 g/mL，提取温度为60 ℃，提取时间4.5 h 条件下，探究烟草秸杆木聚糖提取率与料液比的关系。结果表明，随着料液比的增加，烟草秸秆木聚糖提取率明显升高，而当料液比大于1∶15 时，烟草秸秆木聚糖提取率明显下降，结果表明在料液比1∶15 时提取率最高。

料液比对烟草秸秆木聚糖提取率的影响见图5。

图5 料液比对烟草秸秆木聚糖提取率的影响

2.3 响应面Box-behnken 分析

响应面试验因素与水平设计见表1，Box-behnken试验设计见表2。

表1 响应面试验因素与水平设计

表2 Box-behnken 试验设计

以烟草秸秆的木聚糖提取率为响应值，采用Design Expert 8.0 软件对各试验因素进行回归拟合，得到的回归方程式为：

回归模型方差分析见表3。

表3 回归模型方差分析

从响应面的方差分析可得模型的F检验结果p＜0.01，其差异有统计学意义；失拟度的F检验结果p＞0.05，差异无统计学意义。试验数据与模型相符，模型能够较好地反映试验结果。表3 中显示A、D、AB、AC、AD对木聚糖提取率影响显著（p＜0.05）。B、A2、B2、C2、D2对木聚糖提取率影响极显著（p＜0.01）。两因素的交互作用可通过等高线的密集程度来判断，等高线越密集，木聚糖提取量变化越大，交互作用越明显。曲面越偏呈椭圆，交互作用越大。各因素对烟草秸秆中木聚糖提取率的影响程度为氢氧化钠质量浓度（B） ＞料液比（D） ＞提取时间（A） ＞提取温度（C）。

提取时间与氢氧化钠质量浓度影响木聚糖提取的等高线（a） 及曲面图（b） 见图6。

图6 提取时间与氢氧化钠质量浓度影响木聚糖提取的等高线（a） 及曲面图（b）

由图6（b） 可知，提取时间与氢氧化钠质量浓度的交互作用很强，因为曲面较陡，由图6（a） 可知，当提取时间不变时，氢氧化钠质量浓度为0.15～0.20 g/mL 时可以达到较好的提取效果，当氢氧化钠质量浓度不变时，提取时间在4.5 h 条件下有较好的提取效果。氢氧化钠质量浓度的提取率曲面较提取时间曲面弯曲程度更大，因此氢氧化钠质量浓度比提取时间对木聚糖提取率的影响更重要。

提取温度与提取时间影响木聚糖提取的等高线（a） 及曲面图（b） 见图7。

图7 提取温度与提取时间影响木聚糖提取的等高线（a） 及曲面图（b）

由图7（b） 可知，提取温度与提取时间的交互作用显著，由图7（a） 可知，当提取时间不变时，提取温度为60～80 ℃时可以达到较好的提取效果，当提取温度不变时，提取时间在4.5 h 有较好的提取效果。提取时间的提取率曲面较提取温度曲面弯曲程度更大，因此提取时间比提取温度对木聚糖提取率的影响更重要。

提取时间与料液比影响木聚糖提取的等高线 （a） 及曲面图（b） 见图8。

图8 提取时间与料液比影响木聚糖提取的等高线（a） 及曲面图（b）

由图8（b） 可知，提取时间与料液比的交互作用显著，由图8（a） 可知，当提取时间不变时，在1∶15 的料液比条件下可以达到较好的提取效果，当料液比不变时，提取时间为4.5 h 有良好的提取效果。料液比的提取率曲面较提取时间曲面弯曲程度更大，因此料液比比提取时间对木聚糖提取率的影响更重要。

2.4 条件优化与验证

响应面分析结果显示最佳工艺条件为提取时间4.44 h，氢氧化钠质量浓度0.21 g/mL，提取温度71.62 ℃，料液比1∶15.21。结合实验室实际情况，按提取时间4.4 h，氢氧化钠质量浓度0.21 g/mL，提取温度71.6 ℃，料液比1∶15，控制反应条件，平行3 次验证试验，烟草秸秆木聚糖提取率为26.27%，实际值和理论值25.94 %接近，相对误差为1.3%，试验模型很好地预测了实际值，试验结果理想。

3 讨论与结论

通过响应面方法对提取工艺进行优化，得到的最佳工艺条件为提取时间4.4 h，氢氧化钠质量浓度0.21 g/mL，提取温度71.6 ℃，料液比1∶15。预测烟草秸秆木聚糖最终提取率为25.94%。验证试验测得烟草秸秆木聚糖平均提取率为26.27%，试验值与理论值的误差为1.3%，该模型R2=0.967 8，说明该模型与试验拟合良好，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于该反应的理论推测。调整确定系数R2Adj=0.913 2，说明回归方程与试验值具有高度拟合性，该模型可很好解释响应值的变化，试验的工艺条件提取木聚糖简便快速、绿色环保、效率较高，可为进一步开发商洛地区的烟草秸秆资源提供参考。

在单因素试验中，随着提取时间的增加，烟草秸秆半纤维素（主要是木聚糖） 与其他物质之间的共价键易被破坏，木聚糖完全溶解在碱液中，木聚糖提取率迅速提高，结果显示提取率在4.5 h 后达到最高；而在高温环境下容易产生大量的单糖[13]，因此4.5 h 为较合适的时间。随着氢氧化钠质量浓度的增加，木聚糖更容易从烟草秸秆中提取出来，但氢氧化钠质量浓度不断增加，木聚糖的结构容易被破坏，提取率降低。随着温度的升高，木聚糖分子和溶剂的动能增加，分子扩散加速，使原料充分溶胀，温度继续升高，木聚糖的提取率增加低于1%，但糖的水解、脱水作用增加，生成有害物质，如糠醛等，颜色变深[14]，因此水浴温度为70 ℃较为适宜。随着料液比的增大，溶剂对木聚糖的溶解能力增强，但继续增大料液比，木聚糖溶解速率达到了动态平衡，不再继续溶出，单位体积溶剂的溶解量减少，提取率下降，因此1∶15 为合适的料液比。

试验采用碱法提取，用响应面分析法优化了提取时间、氢氧化钠质量浓度、提取温度、料液比4 个工艺条件。在响应面法中，选择合适的模型，并使用多元二次回归方法作为函数估计工具，多项式近似用于近拟每个因素与多因素试验中指标之间的关系，得到的模型系数与调整系数相近且都大于0.9，说明模型建立比较好，分析函数的轮廓和响应面，并研究响应面和响应因子，因素与因素的关系。响应面法具有试验少、周期短、回归方程精度高等优点，可以研究多个因素之间的相互作用的回归分析方法。Box-behnken 设计可以评价指标和因素间的非线性关系，对试验影响因素的研究比较全面，能够准确反映提取过程的最优条件，并能从图形分析中找到最优的试验考查因子值，对非线性影响因素的预测更具指导性，具有较好的应用价值[15]。

木聚糖是植物秸秆中广泛存在的化合物，资源开发的潜力很大，以烟草秸秆为原材料，采用响应面优化的方法探索提取木聚糖的有利条件，并通过验证试验考查所得工艺条件的准确性，有利于资源的有效利用和环境保护，木聚糖的提取效率增加还可以为木寡糖的制备提供更多原料，制备出更多的加工产品，加速研究成果的转换为经济效益，环境效益，有利于走一条可持续发展的道路。