汪洪涛，郭亚楠

（江苏经贸职业技术学院健康学院，江苏省食品安全工程技术研究开发中心，江苏 南京 211168）

罗汉果是我国特有的一种珍贵葫芦科植物，被誉为良药良果[1]。罗汉果花来自于罗汉果的干雄花，富含黄酮、多酚、精油等活性成分，有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化、清热解毒等功效[2]。目前，对罗汉果花的研究主要集中在其活性成分的提取和性质研究[3]、提取液的生理功能研究方面[4]，对产品的开发应用方面报道较少。

枸杞又称枸杞果、枸杞豆、甜菜子等，是茄科植物，也作为药食两用的植物。枸杞味甘、性平，富含蛋白质、脂肪、枸杞素、维B1、维B2和钙、铁、磷等营养成分，还富含类黄酮、枸杞多糖、甜菜碱、红色素等有效成分[5]，具有补肾益精、润肝明目、增强免疫力、抗疲劳、抗辐射、降血糖，降低动脉硬化等功效[6]。在世界上被公认为抗衰老、抗肿瘤和疾病防治的“神仙果”[5]。目前，枸杞研究的较多，主要集中在活性成分的提取和产品的开发等方面[7-12]，但有关枸杞和罗汉果花搭配进行产品的开发暂未见报道。

为了进一步开发利用农副产品资源，提高农产品的附加值，丰富市场的健康饮料品种，拟通过将罗汉果花和枸杞搭配，利用两者营养成分和活性成分互补的特点，通过酶促降解原料，提高活性成分的溶出率和原料的利用率，开发出一款富含多种活性成分、适合各种人群饮用的健康型饮料。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

KQ-500E 型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；FA1004N 型分析天平，上海民桥精密科学仪器有限公司产品；FW100 型高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司产品；GZX-9140MBE 型数显鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司产品；SHBIII 型循环水多用真空泵，上海比朗文仪器有限公司产品。

罗汉果花，购自广西桂林，买回后挑选、清洗、于60 ℃下烘至恒质量、粉碎过60 目筛后密封备用；枸杞（干果），购自宁夏中宁，经人工挑选、清洗、于60 ℃下烘至恒质量、粗粉碎后密封备用；食品级白砂糖，南京甘蔗园糖业有限公司提供；食品级纤维素酶（绿色木酶，1 万U/g）、β - 葡聚糖酶（食用级，2 万U/g）、柠檬酸，均为分析纯，南京森贝伽生物科技有限公司提供；抗坏血酸（分析纯），上海展云化工有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 加工工艺

（1） 工艺流程。原料→浸泡→酶解→抽滤→调配→均质→包装→杀菌→成品。

（2） 操作要点。①酶解。将枸杞粉和罗汉果花粉按比例复配，按不同料液比、酶配比和酶解时间进行浸提、抽滤，滤液定容后密封冷藏备用。②调配。根据最佳的酶解液加入最佳配方的柠檬酸、白砂糖、抗坏血酸搅拌均匀。③均质。原料混合搅拌均匀，加热至65 ℃。进行均质处理，均质压力20~25 MPa，均质2 次。均质后能提高饮料的稳定性，防止分层，使产品口感细腻。④杀菌。产品装罐后于121 ℃下杀菌10 min 后冷却即得成品。

1.2.2 原料酶解液的制备

（1） 原料酶解液制备的基本工艺参数。先将干燥粉碎后的枸杞粉和罗汉果花粉按质量比1∶1 称取混合至250 mL 锥形瓶中，按照料液比1∶30（g∶mL） 加入一定量的蒸馏水，于室温下避光浸泡12 h，使原料充分吸水。然后在50 ℃的恒温、pH 值为5~6时（加盐酸用精密pH 值试纸） 按照纤维素酶和β -葡聚糖酶1∶1 的质量配比，加入一定量的酶（占原料质量的0.5%），利用超声辅助酶解2 h。最后将酶解液用滤纸进行抽滤，滤液定容后密封冷藏备用，滤渣烘干至恒质量后称量，计算原料的利用率。每个样品重复3 次，取平均值。原料利用率计算见公式（1）：

（2） 原料酶解液制备单因素试验。按1.2.2（1）的方法，以原料的利用率为考查指标，其他条件不变，分别改变枸杞和罗汉果花配比、料液比、纤维素酶和β - 葡聚糖酶配比及酶解时间等因素来考查各种因素对原料利用率的影响。

（3） 响应面优化试验。在单因素试验的基础上，选择原料比、料液比和酶配比作为试验因素，利用响应面软件进行试验及优化，确定罗汉果花枸杞复合饮料酶解液的最佳工艺。

Box-behnken 设计因素与水平设计见表1。

表1 Box-behnken 设计因素与水平设计

1.2.3 复合饮料的研制

（1） 饮料配方的基本工艺参数。量取一定量的酶解液，以酶解液质量为标准，加入5%白砂糖，0.04%柠檬酸，0.05%抗坏血酸，按照饮料制备工艺流程操作得到罗汉果花枸杞复合饮料。

（2） 单因素试验。按1.2.3（1） 的方法，以感官评价为评定指标，其他条件不变，通过改变白砂糖、柠檬酸和抗坏血酸的含量，考查各种因素对饮料风味的影响。

（3） 响应面优化试验。在单因素试验的基础上，利用响应面软件进行试验及优化，采用感官评分法进行分析和处理，确定罗汉果花枸杞复合饮料的最佳配方。

响应面试验因素与水平设计见表2。

表2 响应面试验因素与水平设计/%

1.2.4 感官评分标准

参照相关茶饮料感官标准，结合该产品的特点，指定了产品感官评分标准。请10 名不同年龄、性别的学生根据感官评分表进行评分，每个样品重复3次，最后取评分的平均值。

感官评分标准见表3。

表3 感官评分标准

1.2.5 数据分析与处理

试验数据采用Excel 2010 软件和Design Expert8.0 软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 原料酶解液的制备

2.1.1 原料酶解液制备单因素试验

按照1.2.2 中（2） 的方法，其他条件不变，分别改变枸杞与罗汉果花质量比为4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4（g∶g），料液比为1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45（g∶mL），纤维素酶和β - 葡聚糖酶的质量比为4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4（g∶g），酶解时间为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h 进行单因素试验。

枸杞和罗汉果花的质量比对原料利用率的影响见图1，料液比对原料利用率的影响见图2，纤维素酶和β - 葡聚糖酶质量比对原料利用率的影响见图3，酶解时间对原料利用率的影响图4。

图1 枸杞和罗汉果花的质量比对原料利用率的影响

图2 料液比对原料利用率的影响

图3 纤维素酶和β - 葡聚糖酶质量比对原料利用率的影响

图4 酶解时间对原料利用率的影响

由图1 可知，随着罗汉果花比例的增加原料利用率在逐渐降低，原因可能是罗汉果花中纤维较多，水解率较低。在枸杞和罗汉果花的质量比为2∶1~ 1∶2 原料的利用率降低的非常明显。枸杞比例过高对产品的口感有影响且不利于渣液分离，综合考虑后选取枸杞和罗汉果花的质量比为2∶1、1∶1，1∶2为响应面试验的试验因素水平；由图2 可知，随着料液比的增加原料利用率在逐渐提高，在1∶30 处提高最为明显，随着料液比的继续增加，原料利用率增加变慢。综合考虑后选取料液比为1∶30、1∶35，1∶40 为响应面试验的试验因素水平；由图3 可知，随着β - 葡聚糖酶比例的增加，原料利用率先增加后减少，在1∶3 处最高，在1∶3 之后开始降低。故选取纤维素酶和β - 葡聚糖酶的质量比为1∶2， 1∶3，1∶4 为响应面试验因素的水平；由图4可知，随着酶水解反应时间的延长，原料利用率先增加后减少在2 h 时处最大，随着时间不断延长，原料利用率处于相对平稳状态，而且不利于试验的操作，浪费时间。综合考虑后，将2 h 作为后续试验的酶解时间。

2.1.2 响应面优化试验

根据单因素试验结果，按照1.2.2 中（3） 的方法，采用Box-behnken 试验设计，对原料酶解液工艺进行响应面优化试验。

响应面优化试验方案及结果见表4，原料利用率方差分析见表5。

表4 响应面优化试验方案及结果

表5 原料利用率方差分析

通过软件Design Expert 8.0 对表5 数据进行了回归分析，得出以原料酶解液的原料利用率为响应值的回归方程为：

一次项F值的大小与因素对响应值的影响程度大小成正比[8]。由表4 可知，每个因素对原料利用率的影响程度顺序为原料比>酶质量比>料液比。模型F值为17.61，p<0.001 说明差异非常显著，失拟项p=0.084 5>0.050 0 差异不显著，模型的相关系数R2=0.952 0，表明模型拟合程度较好。变异系数（Coefficient of Variation，C.V） 2.45%较小，说明该模型能较好地反映真实的试验值。回归模型中的一次项原料比（A） 非常显著，交互项和二次项A2，C2不显著，说明每个因素对原料利用率的影响不是线性关系[13]。

由响应面软件分析可知原料最佳酶解液工艺参数为原料比2∶1，料液比1∶34.73，酶质量比1∶2.26。在此条件下，复合饮料酶解液的原料利用率为60.1%。考虑到方便实际操作将最佳配方优化为原料质量比2∶1，料液比1∶35，酶质量比1∶2.3，并根据优化后的最佳工艺参数进行了5 次平行验证试验，结果表明原料利用率平均为60.6%，与预测值相对偏差为0.83%，得到的最佳酶解液工艺参数可靠。

2.2 复合饮料配方的确定

2.2.1 单因素试验结果

按1.2.3 中（2） 的方法，其他条件不变，分别改变白砂糖添加量为3%，4%，5%，6%，7%；柠檬酸添加量为0.010%，0.025%，0.040%，0.055%，0.060%；抗坏血酸添加量为0.01%，0.03%，0.05%，0.07%，0.09%进行试验。

白砂糖添加量对饮料感官指标的影响见图5，柠檬酸添加量对饮料感官指标的影响见图6，抗坏血酸添加量对饮料感官指标的影响见图7。

图5 白砂糖添加量对饮料感官指标的影响

图6 柠檬酸添加量对饮料感官指标的影响

图7 抗坏血酸添加量对饮料感官指标的影响

由图5 可知，随着白砂糖添加量增加饮料感官评分先增后降，在6%时感官评分最高。当白砂糖添加量较低时，饮料的味道偏淡有少许苦味；白砂糖添加量过高时饮料味道太甜。因此，选取白砂糖添加量5%，6%，7%为响应面试验的因素水平。由图6 可知，随着柠檬酸添加量的增加，饮料的感官评分值也逐渐增大，在柠檬酸添加量为0.04% 时达到最大值。此时饮料酸甜适中，继续增加柠檬酸添加量时，饮料则由于味道太酸导致评分值逐渐下降。因此，选取柠檬酸添加量0.025%，0.040%，0.055%为响应面试验的因素水平。由图7 可知，随着抗坏血酸添加量的增加，饮料的酸度逐渐增加，在抗坏血酸添加量为0.07%时达到最大值，此时饮料酸甜适中。继续增加抗坏血酸量时饮料由于酸度过大而使评分值逐渐下降。抗坏血酸除提供酸味外还是抗氧化剂，加入饮料中可保持其外观和风味。综合考虑后，选取抗坏血酸添加量0.05%，0.07%，0.09%为响应面试验的因素水平。

2.2.2 饮料配方的响应面优化试验

根据单因素试验结果，按照1.2.3（3） 的方法，采用Box-behnken 试验设计，对饮料的配方进行优化。

响应面优化试验方案及结果见表6。

表6 响应面优化试验方案及结果

通过软件Design Expert 8.0 对表6 数据进行了回归分析，得出以饮料感官评分为响应值的回归方程为：

饮料配方试验方差分析见表7。

表7 饮料配方试验方差分析

一次项F值的大小与因素对响应值的影响程度大小成正比[8]。由表7 可知，每个因素对饮料感官评分的影响程度顺序为抗坏血酸添加量>白砂糖添加量>柠檬酸添加量。模型F值为10.48，p=0.002 7<0.05 说明差异显著，失拟项p=0.148 3>0.05 差异不显著，模型的相关系数R2=0.928 3，表明模型拟合程度较好。变异系数（C.V） 2.78%较小，说明该模型能很好的反映真实的试验值。回归模型中的一次项抗坏血酸（C） 显著，交互项不显著和二次项A2非常显著、B2和C2显著，说明每个因素对原料利用率的影响不是线性关系[13]。为进一步考查各因素中交互作用对饮料感官评分的影响，用Design Expert 8.0.6软件绘制三维曲线图（图8）。响应曲面图是每个试验因素响应值的三维空间曲线图，表面的幅度越大，则表明对试验结果的影响越大[14]。等高线图的形状可反映出各因素效应强弱的大小，椭圆形这2 个因素之间的相互作用显著，而圆形则相反[15]。3 个因素可在选定的范围内均能产生最好的响应值，这表明3 个因素的试验范围合理有效，能够最佳反映响应值的影响趋势。

图8 因素交互作用对饮料感官评分的影响

因素交互作用对饮料感官评分的影响见图8。

利用Design Expert 8.0.6 软件分析得出罗汉果花枸杞复合饮料的最佳配方为白砂糖添加量5.9%，柠檬酸添加量0.04%，抗坏血酸添加量0.06%。在此最佳配方下复合饮料感官评分为89.4 分。为了检验响应面优化结果的可靠性进行了5 次平行验证试验，得到饮料的感官评分平均值为90.1 分，与预测值有0.78%的相对偏差。结果表明，得到的复合饮料的最佳配方参数可靠。

3 结论

通过优化原料酶解液的工艺参数，从而大大提高了原料利用率。对饮料的配方进行优化后所生产的复合饮料色泽红亮透明，含有罗汉果花淡淡的清香和枸杞的醇香，口感酸甜可口，无沉淀析出。由于该饮料所使用原料罗汉果花和枸杞本身是一种可食用资源，再加上整个生产过程中仅使用水和食品级酶制剂，无任何化学试剂。其他辅助材料都是可食用级别，利用超声波辅助酶法水解原料具有操作简便、能耗低的特点。因此，该饮料的制作工艺简单，具有原料的特有风味，是一款营养丰富、口感纯正的健康饮料，适合各类人群长期饮用。关于饮料中具体的活性成分和卫生指标有待于进一步的试验。