肖 景 肖 黎 刘 镇 王 懿 李建英 于俊生

（1.江西省新钢中心医院肾内科，江西 新余 338000；2.青岛市中医医院肾内科，山东 青岛 266033）

缺血性肾脏病（Ischemic renal disease，IRD）是肾动脉狭窄（Renal artery stenosis，RAS）引起血流动力学改变，并造成肾小球滤过率下降所致，是一种进展性疾病，可导致终末期肾脏病。而动脉粥样硬化性肾动脉狭窄是RAS 最为常见的类型，且发病率呈明显升高趋势，是中老年尤其是老年患者慢性肾衰竭的常见病种［1］。目前研究［2］认为慢性缺血是肾小管-间质纤维化的独立因素，是肾纤维化的信号，而肾组织血管紧张素II（Ang II）可上调炎症因子促进肾小管间质纤维化。和络泄浊方在单侧输尿管结扎法致肾小管间质纤维化模型中可以减轻肾纤维化［3］，并且临床研究［4］表明其可延缓肾脏病进展。本研究旨在通过干预Ang Ⅱ的表达，探讨和络泄浊方对缺血性肾脏病间质纤维化的干预作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物健康SD 雄性大鼠30 只，鼠龄6～8 周，平均体质量200 g，购自湖北省实验动物研究中心（许可证号SCXK（鄂）2020-0018）。

1.1.2 药物和络泄浊方：当归12 g，川芎12 g，赤芍12 g，白术15 g，制大黄10 g，六月雪30 g，海藻15 g，葫芦巴15 g。由新钢中心医院智慧中药房提供，生药含量1.4 g/mL。

1.1.3 试剂肾组织α 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）鼠抗人单克隆抗体：赛维尔生物科技有限公司，货号：

GB13044；Taq Plus DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker：天根生化科技（北京）有限公司，货号：ET105-01、MD114-02；HiScript®II Q Select RT Super-Mix for qPCR、SYBR Green Master Mix：南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：R233、Q111-02；Trizol：Ambion 公司，货号：15596-026；磷酸盐缓冲液（PBS）：biosharp，货号：BL551A；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗小鼠二抗：武汉三鹰生物技术有限公司，货号：SA00001-1；二氨基联苯胺（DAB）显色液：江苏凯基生物技术股份有限公司，货号：KGP105-100；过氧化氢（H2O2）去离子水：Amresco，货号：E882。聚合酶链反应（PCR）引物由北京擎科生物科技有限公司合成。见表1。

表1 RT-PCR引物序列及大小

1.1.4 仪器实时荧光定量PCR仪：Applied Biosystems，型号：QuantStudio 6；微量分光光度计：杭州奥盛仪器有限公司，型号：Nano-100；PCR 仪：东胜创新生物科技有限公司，型号：EDC-810；水平电泳仪：北京君意东方电泳设备有限公司，型号：JY300；紫外分析仪：北京君意东方电泳设备有限公司，型号：JY02S；显微镜：OLYMPUS，型号：BX53；针灸针：天津华鸿医材有限公司，产品标准GB 2024—2016《针灸针》，津食药监械（准）字第2009 第2270002 号；手术剪：瑞沃德，型号：S12003-09；镊子：瑞沃德，型号：F11003-13；手术线：扬州源康医疗器械有限公司，聚酯线1 号；医用缝合针角针：上海信成医疗器械有限公司，沪械注准20192020430，规格：1/2，6 mm×14 mm。

1.2 方法

1.2.1 模型制作SD 雄性大鼠慢性缺血性肾脏病模型制作方法：将大鼠随机分为3 组，假手术组、模型组和药物组各10 只。模型组和药物组大鼠用10%的水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉，打开腹腔，分离出左侧肾动脉，把直径为0.30 mm 的针灸针与肾动脉血管长轴紧贴平行放置，用1号手术缝线将肾动脉和针灸针一起扎紧，然后抽出针灸针，关闭手术切口；假手术组除不放置针灸针和不用手术缝线紧扎外，其余手术操作均同上。

1.2.2 分组与给药术后假手术组、模型组给予10 mL/（kg·d）生理盐水灌胃；药物组给予和络泄浊方14 g/（kg·d）灌胃。每日1次，连续14 d。

1.2.3 取材术后第14天处死大鼠，取左侧肾脏，沿矢状面切成两半后（兼顾皮、髓质），一半放入10%中性甲醛缓冲液中待做病理及免疫组化（不超过24 h），另一半投入液氮快速冷冻后-80 ℃保存，待行逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。

1.2.4 指标检测

1.2.4.1 肾脏组织染色评定肾小球硬化指数评分与肾小管损伤评分取左侧肾脏，冲洗，去包膜，常规固定、脱水、透明、浸蜡、包埋，制成3 μm 切片，行苏木精-伊红（HE）、马松（Masson）染色。形态学观察以光学显微镜下HE染色为主，结合Masson染色。

肾小球硬化程度：采用Raij 的半定量法计算肾小球硬化指数［5］。肾小管间质损伤指数评分［6］：以肾小管扩张、肾小管萎缩、间质炎症细胞浸润、间质水肿和间质纤维化作为肾小管间质损伤指数评分的指标。每一个样本的肾小管间质损伤指数以20 个视野的评分均值表示，按正常、轻、中、重度分为0～3级，相应记为0～3分。

1.2.4.2 免疫组化法检测α-SMA切片、烤片、脱蜡、水化；热修复后冷却；PBS 缓冲液冲洗；加3% H2O2去离子水，室温孵育20 min，PBS 缓冲液冲洗；滴加稀释一抗（抗α-SMA），4 ℃过夜；室温20 min，PBS 缓冲液冲洗；滴加HRP 抗山羊免疫球蛋白G（IgG）聚合物，37 ℃孵育20 min，PBS 缓冲液冲洗；DAB 显色，镜下观察细胞着色，常规脱水、透明、封片。结果判定：每只大鼠选取10个高倍视野，根据光镜染色指标在小管间质中的分布计算积分［7］。

1.2.4.3 RT-PCR 检测肾组织Ang Ⅱ mRNA 表达（1）总RNA 提取：采用Ambion 公司的Trizol 裂解液裂解肾脏组织，提取组织总mRNA。（2）逆转录：按照南京诺唯赞生物科技股份有限公司的逆转录试剂盒操作，将提取的mRNA 逆转录为cDNA。（3）实时定量PCR 法：以cDNA 为模板行目的基因扩增。检测Ang II在各个标本中的表达水平，扩增目的基因相对表达量：qPCR 算法（相对定量，2-ΔΔCt法）。

1.2.5 统计学方法采用SPSS 17.0统计软件包，分析前检验数据是否符合正态分布，符合正态分布的数据采用（±s）描述，多组独立样本比较采用单因素方差分析，组间比较用LSD法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 光镜改变

2.1.1 3组大鼠HE 染色结果比较假手术组：肾脏组织结构清晰，肾间质无炎症细胞浸润；模型组：肾小球硬化，肾小管结构破坏明显，肾小管上皮大量脱落、坏死，肾小管萎缩，间质大量炎症细胞浸润；药物组：肾组织硬化较模型组减轻，肾小管基底膜相对完整，肾小管上皮细胞部分空泡变性，炎症细胞浸润减轻，肾小球轻度硬化。见图1。

图1 3组大鼠HE染色检测肾组织病理变化（×100）

2.1.2 3 组大鼠Masson 染色结果比较假手术组：肾组织结构清晰，肾间质无纤维组织增生；模型组：皮髓质胶原纤维广泛沉积；药物组：胶原纤维增生较模型组减轻。见图2。

图2 3组大鼠Masson染色检测肾组织胶原沉积（×400）

2.2 3 组大鼠肾组织病理评分比较与假手术组比较，模型组的肾小球硬化指数及肾小管间质损伤程度明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，药物组的肾小球硬化指数及肾小管间质损伤程度明显降低（P＜0.01）。见表2。

表2 3组大鼠肾小球硬化指数及肾小管间质损伤评分比较（±s）

表2 3组大鼠肾小球硬化指数及肾小管间质损伤评分比较（±s）

注：与假手术组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01。

组别假手术组模型组药物组肾小管间质损伤评分/分0 2.56±0.261）1.47±0.321）2）鼠数10 10 10肾小球硬化指数/%0 1.40±0.191）0.66±0.091）2）

2.3 3 组大鼠肾组织α-SMA 的表达比较免疫组织化学检测各组大鼠肾组织中α-SMA 的表达情况。见图3。结果显示假手术组血管平滑肌表达α-SMA；模型组肾间质可见条索状α-SMA 棕黄色染色颗粒，明显强于其他2 组（P＜0.05）；药物组则介于假手术组及模型组之间，与2 组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

图3 3组大鼠免疫组化检测肾组织中α-SMA的表达（×100）

表3 3组大鼠肾小管间质α-SMA表达比较 （±s）

表3 3组大鼠肾小管间质α-SMA表达比较 （±s）

注：与假手术组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。

α-SMA 0.42±0.92 2.58±0.161）1.23±0.161）2）组别假手术组模型组药物组鼠数10 10 10

2.4 3 组大鼠肾脏Ang Ⅱ表达比较检测肾脏组织局部Ang II RT-PCR，与假手术组比较，模型组、药物组肾脏Ang II 表达均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，药物组肾脏Ang II明显下降（P＜0.05）。见图4。

图4 3组大鼠RT-PCR检测肾组织Ang II mRNA表达

3 讨论

慢性缺血性肾损害是肾间质纤维化的一个独立影响因素，肾脏缺血时，肾内RAS 系统被激活，进而促进肾间质纤维化，而Ang II 是主要的纤维化因子，与Ang II 受体、转化生长因子β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子、表皮生长因子受体、低氧诱导因子-1α 等密切相关，参与肾间质纤维化，而肾小管上皮细胞间质转化是纤维化的重要机制，α-SMA 的表达标志着肌成纤维细胞的激活［8］，可作为慢性缺血性肾脏病纤维化的指标。故抑制Ang II 的表达或抑制其信号通路，可以延缓肾脏病进展。目前西药应用血管紧张素转化酶抑制剂类药物（ACEI）或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB）可以减轻和延缓肾脏病进展，但仍有部分患者对该类药物存在禁忌证，需慎用。而中药不论是复方制剂还是单味药均证实具有延缓肾脏病进展的优势作用。本实验则以α-SMA 表达及肾小管间质损伤程度来探讨和络泄浊方对Ang II 的表达影响，进而探讨中药对Ang II的干预作用。

中医学认为，缺血性肾脏病基本病机为肾络损伤，肾络绌急，久病入络，进而肾络郁滞、瘀阻、瘀塞导致肾络微型癥瘕，最终导致肾衰竭。既有湿热、血瘀、湿浊、水湿等“实邪”，又有中医认为的“久病必虚，阴阳失衡”，故在治疗上强调“扶正祛邪”。和络泄浊方为名老中医于俊生的临床经验方，根据络病理论及临床研究，在当归芍药散的基础上最终形成和络泄浊方。具体由当归、川芎、赤芍、白术、制大黄、六月雪、海藻、葫芦巴组成，具有补益脾肾、活血通络、解毒祛瘀的作用。方中以当归、川芎、赤芍补血活血凉血祛瘀，体现了中医“以通为补”的学术思想，正如《黄帝内经》所言“疏其血气，令其调达，而致和平”。后世医家唐容川强调“此血在身，不能加于好血，而反阻断新血之化机，故凡血症，总以祛瘀为要”。现代药理研究［9］表明，活血化瘀药物在改善血液循环的同时，可以增加脏腑的血流量，修复脏腑的损伤。本研究发现，和络泄浊方干预后，大鼠肾纤维化病理损伤明显减轻，Ang II、α-SMA表达明显下降。

综上所述，和络泄浊方延缓缺血性肾脏病可能与Ang II相关，其机制可能为抑制Ang II表达从而抑制上皮细胞转化分化及细胞外基质沉积。本研究为临床研究和络泄浊方延缓缺血性肾脏病肾间质纤维化进展提供新的可靠实验依据。