卢兴霞，姚彤亮，柴慈江，时海东

（天津农学院 园艺园林学院，天津 300392）

珠美海棠（Malus Zumi）为蔷薇科苹果属植物，具有较强的抗逆性，抗白粉病和黑星病，且较耐涝，尤其具有较强的耐盐能力，在含盐量0.4%左右的土壤中能够正常生长与开花结果[1]，可以作为盐渍地区的绿化树种和苹果砧木推广应用。利用组培快繁技术是快速获得珠美海棠大量优质苗木的有效途径。关于珠美海棠组培快繁技术的研究报道首见于1981 年[2]。目前，珠美海棠组培快繁技术已趋于成熟[3]，并且在有的地区已经形成了组培苗木的规模化生产[4]。

降低试管苗的成本可以提高珠美海棠组培苗的生产效率。在珠美海棠试管苗生根培养中，通常使用琼脂培养基并在恒温培养室进行培养。大量琼脂的使用及恒温培养室的电力消耗是导致试管苗成本升高的主要原因。冯雪赞等对珠美海棠试管苗的气培生根技术进行了研究，使珠美海棠试管苗茎段在空气中生根率达80%以上[5]，柴慈江等以土壤做培养基支撑物可以使珠美海棠试管苗生根率达到100%[6]，这两项研究都省去了琼脂的使用，降低了试管苗成本。宋秋月等[7]和王然等[8]进行了栒子试管苗的室外瓶内生根试验，生根率最高可达95.9%。黄洁萍等、董媛媛等和夏瑞等分别对北美海棠、葡萄和樱桃李试管苗的室外瓶内生根进行了研究，均取得了比较理想的结果[9-11]。杨广艳等研究表明室外培养的珠美海棠试管苗的生根效果与培养室等环境无显著差异[12]，显示也可以将珠美海棠试管苗的生根培养放在室外进行。在此基础上，本研究探讨了遮阴方式与培养时期对珠美海棠试管苗室外瓶内生根的影响，以期完善珠美海棠试管苗的室外瓶内生根技术，减少电力消耗及设施投入，进一步降低成本。目前国内尚未见关于试管苗室外瓶内生根的其他研究报道。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为在含有0.5 mg/L 6-BA 的MS培养基中继代培养4 代的珠美海棠试管苗，试管苗长至2～3 cm 时取茎段用于各项试验。其中，用于2016 年4 月中旬不同遮阴方式试验的试管苗茎段取自继代培养约100 d 的珠美海棠试管苗，其余各项试验所用试管苗茎段均取自继代培养40～60 d的试管苗。配制生根培养基使用的土壤为取自本校绿地的黏壤土，6 月份取土装入瓦盆并放于地表，经夏季雨水淋洗后，当年10 月份将风干后的土壤过1mm 筛备用。该黏壤土pH 值为8.2，含盐量0.41‰。市场购买小粒蛭石同样过1 mm 筛备用。试验用遮阳网透光率约为40%。

以200 mL 大口瓶为培养容器。将上述黏壤土和蛭石按照1∶2的体积比混合均匀，装入大口瓶。然后加入培养液，培养液的成分为含有0.5 mg/L IBA 和15 g/L 蔗糖的蒸馏水，pH 值调至6.0。加入培养液后，用封瓶膜封口，然后将培养瓶放在高压灭菌器中灭菌，灭菌方法为在0.11～0.12 Mpa（121 ℃）条件下保持20 min。灭菌后，当培养基冷却后，用胶粘带把封瓶膜的透气孔粘住以防水分蒸发过快和在露地进入雨水。在超净工作台上每个培养瓶内接种5 个约1.5 cm 的珠美海棠试管苗茎段。将接种了珠美海棠试管苗茎段的培养瓶用于各项试验。

1.2 试验方法

1.2.1 室外环境中不同遮阴方式的试验

该试验在2016 年4 月中旬、日最低温稳定在10 ℃以上时进行。试验地点为天津农学院东校区地被植物试验园。遮阴方式设树荫遮阴、双层遮阳网遮阴和三层遮阳网遮阴3个处理，具体如下：

树荫遮阴：在地被植物园南边选择一株国槐用于遮阴，树高约6 m，冠径约4 m，干高约2.5 m。将接种了珠美海棠试管苗茎段的培养瓶放置在树冠下树干的北面，培养瓶的东西两面竖向放置一层遮阳网，使培养瓶避免阳光的直接照射。

双层遮阳网遮阴：在地被植物园空旷地面搭建小拱棚，小拱棚的顶部和东、南、西三面用双层遮阳网覆盖，然后将培养瓶放在小拱棚内。

三层遮阳网遮阴：如上法搭建小拱棚，并在小拱棚的顶部和东、南、西三面用三层遮阳网覆盖，然后将培养瓶放在小拱棚内。

试验按完全随机法设计。每处理均接种6瓶，共30 个试管苗茎段进行生根培养。培养期间，取一个未接种试管苗茎段的含有土壤培养基的培养瓶，将最高温度计的感温端插入封瓶膜置于瓶内悬空处，每隔5 d 观测一次各处理培养瓶内的最高温，同时用学联牌JD-3 型数字式照度计测定各处理培养瓶顶部的光照强度。

培养40 d 后，各处理统计生根率，并用卡方测验的方法做显著性测验，同时调查各处理所有成活试管苗的根长、根数、茎长、叶数等指标，并按照完全随机试验单向分组资料的统计分析方法做方差分析。

1.2.2 室外环境中不同培养时期的试验

2016、2017 和2018 年每年在4 月下旬至6月下旬和9 月上旬，按照上述1.1 中的方法配制土壤支撑培养基，取继代培养40～60 d 的珠美海棠试管苗，剪取长约1.5 cm 的试管苗茎段接入培养基，用封瓶膜封口后再用透明胶带将封瓶膜透气孔封堵。然后将接种了珠美海棠试管苗茎段的培养瓶放置于树荫下（培养地点及树荫遮阴方式均同试验1.2.1）进行培养。培养瓶放置在室外的具体时间分别为：2016 年：6 月19 日和9 月7 日；2017 年：4 月21 日，4 月29 日，5 月22 日和9月11 日；2018 年：4 月27 日和9 月7 日。40 d后调查试管苗生根与生长状况。试管苗生根与生长指标的调查和统计分析的方法均与试验1.2.1相同。培养期间培养瓶内最高温和培养瓶顶部光照强度的测定也同试验1.2.1。

2 结果与分析

2.1 室外环境中不同遮阴方式对珠美海棠试管苗生根培养的影响

不同遮阴方式下珠美海棠试管苗生根培养结果见表1。

表1 室外环境中不同遮阴方式对珠美海棠试管苗生根培养的影响

由表1 可见，3 种遮阴处理下培养的珠美海棠试管苗的根长、根数、生根率、茎长和叶数均无显著性差异，表明这3 种遮阴方式对试管苗根系发生与生长的影响效果一致。

根据气象资料，4 月中旬开始，每日的最低气温已经稳定在10 ℃以上，不会成为试管苗生长的限制因子。但是随着气温升高和阳光照射，培养瓶内的最高温可能会限制试管苗生长。

由图1 可见，培养期间，3 种遮阴方式下培养瓶内的最高温度明显受到瓶内接受光照强度的影响。双层遮阳网遮阴的培养瓶内接受了较多光照（平均光照强度为6 777 lx），因此其最高温明显高于三层遮阳网遮阴（平均光照强度为3 325 lx）。树荫遮阴的瓶内最高温在培养前期与双层遮阳网遮阴相似，后期则与三层遮阳网遮阴一致，这可能是前期树冠枝叶稀疏光照较强，后期树冠郁闭光照较弱的缘故。总体上看，3 种遮阴处理瓶内最高温虽然有差异，但都在25～35℃范围内波动，没有出现35 ℃以上的高温。从光照条件看，一般恒温培养室中人工光源提供的光照强度为3 000 lx左右，而处于培养瓶顶部的光照强度仅为2 000 lx左右。本试验中，以树冠郁闭后的树荫下光照强度最低，但仍然可以达到2 000 lx 以上，因此，3种遮阴方式均可以满足试管苗对光照强度的需要。3 种遮阴方式中双层遮阳网遮阴处理的光照强度最强，虽然3 种遮阴方式下的根长、茎长和叶数等指标无显著差异，但该处理比其他两个处理有促进根系和茎叶生长的趋向，这可能意味着增强光照具有促进试管苗生长的潜力，对此有待于进一步研究。尽管在温度、光照方面存在一定差异，但在4 月中旬至5 月下旬这3 种遮阴方式对珠美海棠试管苗的室外瓶内生根都是适宜的。

图1 室外3种不同遮阴条件下培养瓶内最高温度变化情况

3 种遮阴处理培养的珠美海棠试管苗生长状况见图2。

图2 室外3种不同遮阴条件下珠美海棠试管苗的生长状况

2.2 室外环境中不同培养时期对珠美海棠试管苗生根培养的影响

室外环境中不同时期培养的珠美海棠试管苗生根效果见表2。

表2 室外环境中不同培养时期对珠美海棠试管苗生根培养的影响

由表2 可见，2016 年两个时期培养的试管苗生根率分别为80.0%和90.0%，两者差异不显著。两者根数、茎长、叶数等指标差异也不显著；但9月7 日—10 月17 日培养时期的根长显著高于前者，表明该时期优于6 月19 日—7 月29 日时期。2017年四个时期培养的试管苗生根率无显著差异，为87.3%～97.8%，叶数也无显著性差异；但是4 月29 日—6 月8 日培养的试管苗的根长显著高于其他各时期，4 月21 日—5 月31 日培养的试管苗的根数、茎长显著高于其他各时期，综合来看，这两个培养时期培养的试管苗生长质量优于5月22日—7 月1 日和9 月11 日—10 月21 日两个培养时期。2018 年9 月7 日—10 月17 日培养的试管苗生根率为97.5%，显著高于4 月27 日—6 月6 日的生根率（88.4%）。

总体来看，9 月初至10 月下旬培养的试管苗生根率较高，3 年间均达到90%以上，但是根长或根数、茎长等指标显著低于4 月下旬至6 月上旬培养的试管苗（2017 年），其原因可能是该时期培养的前期，瓶内最高温多在30 ℃以下，对生根有利，而后期（培养30 d 后）瓶内最高温度降至20 ℃以下（图3），较低温度可能对试管苗的生长产生了一定抑制作用。

图3 2017 年不同培养时期培养瓶内的最高温度变化情况

5 月下旬至7 月初（2017 年）培养的试管苗生根率略低于90%，达到87.3%，各项生长指标与9 月初至10 月下旬培养的试管苗无显著性差异，但根长、根数或茎长等至少有一项指标显著低于4月下旬至6 月上旬培养的试管苗。由图3 可见，该培养时期的后半段（约20 d）瓶内最高温均超过了35 ℃，较高的温度可能对试管苗的生长产生了一定抑制作用。

上述结果中6 月中旬至7 月底（2016 年）培养的试管苗生根率最低，为80.0%，根数、茎长、叶数等指标与9 月初至10 月中旬培养的试管苗无显著差异，但根长则显著低于9 月初至10 月中旬培养的试管苗。因此，该培养时期试管苗的生长质量在所有结果中也是最差的。6 月中旬至7 月底自始至终瓶内最高温都在35 ℃左右徘徊（图4），这种持续的较高温度可能对试管苗生根及生长都产生了抑制作用，导致生根率有所降低及生长质量显著下降。

图4 2016 年不同培养时期培养瓶内的最高温度变化情况

4 月下旬至6 月上旬培养的试管苗生根率较高，2017 年为91.1%～97.8%，2018 年较大试验样本的生根率也达到88.4%，该时期的生长质量明显优于其他时期。该时期培养瓶内最高温多在25～30 ℃变化且未出现35 ℃高温（图3，图4），温度适宜可能是该时期生根率较高且生长质量较好的原因之一。此外，该培养时期的前期树冠未郁闭，光照强于其他时期（树冠完全郁闭），较强的光照也利于试管苗的生根与生长。

综上所述，在天津农学院所处气候条件下，珠美海棠试管苗室外瓶内生根培养的适宜时期为4 月下旬至7 月初和9 月上旬至10 月中旬，其中以4 月下旬至6 月上旬为最佳培养时期。

3 讨论与结论

试管苗的生根培养可以分为瓶内生根和瓶外生根两种方式[13]。一般认为瓶外生根的生根率略低于瓶内生根[14]。对于难生根植物，瓶内生根还是唯一选择[15]。

试管苗的瓶内生根通常使用琼脂培养基并在恒温培养室进行，成本较高且移栽困难。柴慈江等[16]和韩会会等[17]利用土壤支撑的培养基进行试管苗的温室内瓶内生根取得了理想的结果，既节省琼脂和电力消耗而降低成本，又提高了试管苗移栽成活率。将试管苗的瓶内生根放在室外进行，则可以减少温室设施的投入，进一步降低成本。杨广艳等[12]和宋秋月等[7]的研究表明了试管苗室外瓶内生根的可行性。

温度与光照的调节是试管苗室外瓶内生根成功与否的关键，而光照又对温度有直接的影响。在天津平原地区，4 月中旬日最低温可以稳定在10 ℃以上，此时开始培养可以避免低温的影响，温度调控的重点在于避免高温的危害，而适度遮阴可以明显降低培养瓶内温度。柴慈江等在栒子试管苗温室瓶内生根中，采用双层遮阳网遮阴的瓶内最高温基本上低于33 ℃，未遮阴则高达39 ℃[16]。王然等在栒子试管苗的室外瓶内生根中，4 月下旬至5 月底采用树荫遮阴可使瓶内最高温度控制在35 ℃以下[8]。本项研究中，4 月中旬至5 月下旬采用双层遮阳网、三层遮阳网或树荫遮阴，均可以使培养瓶内最高温度控制在35 ℃以下。采用树荫遮阴方式，至6 月上旬仍可以控制瓶内最高温低于35 ℃。这些研究显示采用适当的遮阴措施，可以避免瓶内出现过高温度，从而为试管苗提供良好的温度条件。遮阴会降低培养瓶内的光照强度，本试验中以树冠郁闭后的树荫遮阴光照强度最低，但是仍然可以达到2 000 lx 以上，与恒温培养室中人工光源下的光照强度相似，因此能够满足试管苗生长的需要。所以，在4 月中旬至6月上旬，采取适当的遮阴措施，既可以避免温度过高，又能够满足光照需求，这为试管苗的室外瓶内生根提供了保证。

室外环境中培养瓶内温度在很大程度上受环境气温影响，而环境气温的变化完全由季节变化决定。因此，除遮阴外，选择适宜的培养时期也非常重要。在天津平原地区，炎热的夏秋季节，单纯的遮阴措施难以抑制瓶内高温。本项研究中，6 月中旬至7 月份即使在遮阴条件下培养瓶内最高温仍然超过35 ℃，特别是7 月中下旬最高气温频繁达到36～37 ℃，通过遮阴降温已很难奏效。此时培养的试管苗生根率下降且生长受到明显的抑制。因此，7 月的暑热时期不适于进行试管苗的室外生根培养。8 月上中旬仍处于暑热之中，11月至翌年3 月则处于秋末春初的低温及冬季的严寒时期，这些时期理论上也不适于试管苗的室外生根培养。

秋季的温暖时期（9 月初至10 月中旬）是试管苗室外瓶内生根比较适宜的时期。此时期前期瓶内最高温大多在25～30 ℃之间变化，温度适宜且稳定，试管苗生根率较高。本研究连续3 年的试验中，此时期的生根率均达到90%以上。但由于后期温度较低，瓶内最高温甚至低至20 ℃以下，致使此时期试管苗的生长质量显著低于4 月下旬至6 月上旬培养的试管苗。由于8 月下旬日最高气温一般已降至35 ℃以下，如将该时期的培养提前至8 月下旬开始，至10 月初结束，则有可能避免后期低温的影响。或者进入10 月后，由树荫遮阴改为双层遮阳网遮阴以提高培养瓶内温度。这些都有待于进一步研究。

5 月下旬至7 月初是试管苗室外瓶内生根的另一个较适宜时期。此时期前期温度适宜有利于根系发生，生根率接近90%，但后期瓶内最高温逐步超过35 ℃抑制试管苗生长，生长质量明显低于4 月下旬至6 月上旬的试管苗，而与9 月初至10 月中旬的试管苗无显著差异。

春末夏初（4 月中下旬至6 月上旬）是试管苗室外瓶内生根最适宜的时期。此时最低气温已经稳定在10 ℃以上，适当遮阴可使瓶内温度控制在35 ℃以下，温度适宜，且光照也可以满足试管苗需求。本项研究中此时期内培养的珠美海棠试管苗生根率达到88.4%～97.8%，生长质量也优于其他各培养时期。需要指出的是，本研究在2016 年该时期的生根率仅为20.0～33.3%，明显偏低，其原因可能与接种的试管苗茎段自身的生理状态有关。该试管苗茎段取自继代培养约100 d 的试管苗，而且其继代培养期间在寒假阶段因空调故障经历了20 余天的较低温度培养，低温期间培养室温度仅为11～20 ℃。继代培养时间过长和低温的影响，可能使试管苗接近于休眠状态，其叶片中可能积累了较多的脱落酸，影响到内源激素的平衡，因此抑制了根系发生。对此尚待进一步研究。2017年和2018 年该时期的培养均采用在常规温度（23～27 ℃）下继代培养40～60 d 的试管苗茎段接种，并取得了理想的结果。因此，去除2016 年试验的非正常因素影响，2017 年和2018 年的试验结果可以说明4 月下旬至6 月上旬是试管苗室外瓶内生根的最适宜时期。

黄洁萍等在4 月下旬进行北美海棠试管苗室外瓶内生根，生根率达到90.6%[9]。董媛媛等在6月份进行葡萄试管苗室外瓶内生根，生根率达到92.5%[10]。夏瑞等在9 月下旬进行樱桃李试管苗室外瓶内生根，生根率为83.3%，与恒温培养室培养的无显著差异[11]。宋秋月等研究认为4 月21 日至5 月31 日是栒子试管苗室外瓶内生根的适宜时期，5 月22 日至7 月1 日是次适宜时期[7]，这些研究与本研究结果基本一致。

室外瓶内生根的试管苗可以不经过炼苗，开瓶后直接移入田间土壤[8]，这样可以摆脱炼苗阶段对温室的依赖，更加凸显了室外瓶内生根的意义。朱霖等研究认为珠美海棠试管苗田间直接入地移栽的适宜时期为4 月下旬至6 月上旬[18]，即最迟应在6 月上旬完成。因此，从生根与移栽的衔接方面考虑，也以4 月下旬至6 月上旬为珠美海棠试管苗室外瓶内生根培养的最佳时期。

综合上述认为，在天津农学院所处气候条件下，4 月中旬至5 月下旬，在室外采用树荫、双层遮阳网或三层遮阳网遮阴可以控制培养瓶内温度在35 ℃以下，培养瓶顶部接受的光照强度达到2 000 lx 以上，3 种遮阴方式下培养的珠美海棠试管苗生根及生长指标无显著差异，3 种遮阴方式均可用于试管苗培养；在树荫遮阴下，珠美海棠试管苗室外瓶内生根的适宜时期为4 月下旬至7 月初和9 月上旬至10 月中旬，其中以4 月下旬至6月上旬为最佳培养时期。本结果将为进一步降低珠美海棠试管苗培养成本及促进珠美海棠离体快繁技术的生产应用提供依据。