吴玲，曾秋霞，冯银仲，邓绮娜，黎箐

江门市妇幼保健院产科，广东江门 529000

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus,GDM）指在妊娠期首次发生或发现的糖代谢异常，其主要的特征是葡萄糖耐受不良，是妊娠期最常见的代谢紊乱性疾病[1]。妊娠期高血糖近年来发生率逐年升高[2-4]，可导致系列不良临床结局，如死产、妊娠期高血压、产后出血、羊水过多、胎儿窘迫、早产、巨大儿等[5-7]，增加产后妇女患2 型糖尿病和肥胖症风险[8]。遗传因素是导致2 型糖尿病发生发展的关键因素，超过20 种遗传变异与糖尿病和其他代谢标志物有关，尤其是TCF7L2 基因的多态性rs7903146[1]。

GDM 发病机制尚不完全清楚，胰岛素抵抗和胰腺β 细胞异常是主要因素。目前的研究显示其发病相关风险因素包括妊娠史、年龄、较高的体质指数、糖尿病家族史等。多数遗传学研究都集中在与2 型糖尿病相关的变异体上，在与易感性相关的遗传多态性中具有一定相似性，如MTNR1B，TCF7L2和CDKAL1 等遗传多态性[9]。这些多态性和GDM风险之间的联系尚存争议，取决于诊断标准、基因型方法和病例对照研究的人群特征[10]，因此，需在临床实践中开展进一步的验证性研究。本研究选取2021 年3 月—2022 年5 月江门市妇幼保健院接收的378 例孕妇作为研究对象，其中GDM 孕妇90例，产检健康孕妇288 例。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取于本院产检的378 例孕妇作为研究对象。招募时获得了所有参与者的书面同意。本研究经江门市妇幼保健院伦理委员会批准。

1.2 诊断标准

根据中华医学会妇产科学分会产科学组、中华医学会围产医学分会、中国妇幼保健协会妊娠合并糖尿病专业委员会共同制订的《妊娠期高血糖诊治指南（2022）[第一部分]》的建议定义GDM[11]。简而言之，在妊娠24～28 周时，口服75 g 口服葡萄糖耐量试验后，空腹血糖≥5.1 mmol/L 和（或）1 h 血浆葡萄糖≥10.0 mmol/L 和（或）2 h 血浆葡萄糖≥8.5 mmol/L的截断点来诊断GDM。

1.3 纳入与排除标准

纳入标准：①所有登记的参与者年龄都在18 岁以上；②参与者胎龄24～28 周；③自愿参与者。

排除标准：①患有其他类型的糖尿病者；②在诊断为GDM 之前（妊娠24～28 周之前），患有心脏、肝脏或肾脏疾病、甲状腺功能障碍和多囊卵巢综合征者；③有双胎或多胎妊娠者；④采用辅助生殖技术的妊娠期妇女；⑤在怀孕期间服用了影响葡萄糖代谢的药物者；⑥妊娠期高血压或先兆子痫的妊娠期妇女；⑦酗酒以及药物成瘾的妊娠期妇女；⑧妊娠检查信息不完整的妊娠期妇女。

1.4 方法

收集妊娠期妇女的年龄、体质指数、妊娠史、既往GDM 病史和糖尿病家族史。采集2 mL EDTA 抗凝的外周血，保存于-80℃待分析。

DNA 分离：本研究使用天根血液DNA 纯化试剂盒（天根生物科技有限公司，AP348，北京，中国）分离和纯化基因组DNA。简述如下：①向200 μl 外周血白细胞中加入20 μl 的蛋白酶K，上下颠倒混匀；②向①中加入200 μl GD，轻轻涡旋10 s，并于56℃水浴锅中孵育10 min，期间颠倒混匀数次至溶液澄清透亮；③将样本从水浴锅中取出，室温静置数分钟后，加入200 μl 的无水乙醇，轻轻涡旋混匀后；④将溶液转移至吸附柱中，14 000 rpm 离心1 min，弃去滤液；⑤向柱中加入500 μl 的PW，室温静置2 min，14 000 rpm 离心1 min，弃去滤液；⑥重复④一次；⑦打开吸附柱的盖子，室温放置10 min后，向吸附中间位置加入100 μl 的TE 缓冲液，14 000 rpm 离心2 min，所得滤液即为DNA；⑧所有DNA 保存在-20℃直到基因分型。

基因分型：本研究采用已建立的Agena MassARRAY 系统方法对根据先前研究选择的4 种单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）进行基因分型，包括CDKAL1 rs7754840、IGF2BP2 rs1470579、MTNR1B rs10830962 和TCF7L2 rs7903146。Agena MassARRAY 系统基因分型的方法简述如下：①使用分析设计套件2.0 软件来设计合适的引物。②多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR），多重PCR 体系的配置如下：氯化镁（25 mmol，0.4 μl）、dNTP混合物（25 mmol, 0.1 μl）、引物混合物（1 μM，0.5 μl）、多重PCR 酶（5 U/mL,0.2 μl）、DNA 模板（5 ng/mL, 2 μl）并补充无酶水至5 μl；多重PCR 反应条件如下：95℃预变性2 min；95℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共45个PCR 循环；最后72℃延伸5 min。③SAP 反应，反应体系配置如下：SAP缓冲液（0.17 μl）、SAP酶（0.3 μl）以及无酶水1.53 μl；反应条件如下：37℃孵育40 min，85℃失活5 min。④延伸反应：反应体系配置如下：多重延伸反应缓冲液（0.2 μl）、多重延伸反应终止液（0.2 μl）、特异性的延伸引物混合物（0.94 μl）、延伸反应的酶（0.041 μl）；反应条件如下：94℃变性30 s；94℃变性5 s，以下步骤5 个循环：52℃退火5 s和80℃延伸5 s，共40 个循环；最后72℃延伸5 min。⑤反应完成后，将反应板取出室温3 700 rpm，离心1 min 后，向每个孔中加入树脂，万向摇床室温孵育20 min，除去样本中的盐分。⑥采用MassARRAY RS1000 将反应液转移到芯片上，并将芯片置于质谱仪中获取反应图谱。检测分析流程由瑞因生物科技（广州）有限公司完成。

1.5 统计方法

采用R 4.1.0 统计学软件（奥地利研发核心团队）对数据进行分析，计量资料经检验符合正态分布，采用（±s）表示，组间差异比较进行t检验；计数资料采用例数（n）和率表示，组间差异比较进行χ2检验。SNP 和GDM 之间的关联通过SNPassoc 2.0.2软件包实现，并获取具有显著性的基因多态性；为了进一步明确妊娠期妇女的发生GDM 风险的风险因素，本研究利用Glmnet 3.0.2 软件包结合Logistic回归分析，明确GDM 的风险因素。同时，本研究采用ggplot2 3.4.2 进行可视化。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组研究对象基本特征比较

378 例研究对象中经产妇217 例和初产妇161例，孕妇有糖尿病史15 例，研究对象有糖尿病家族史29 例。口服葡萄糖耐量试验后，被确定患有GDM 90 例。健康孕妇和GDM 孕妇年龄、体质指数、妊娠史、GDM 病史、糖尿病家族史比较，差异有统计学意义（P＜0.05），是其患病风险的高危因素，见表1。

表1 两组研究对象基本特征比较

2.2 候选SNPs 与GDM 的关联分析

使用χ2检验评估4 个候选SNPs 与GDM 风险之间的关联。TCF7L2 rs7903146（P=0.038），见图1C，而不是IGF2BP2 rs1470579（P=0.670），见图1A，CDKAL1 rs7754840（P=0.430），见图1B，或MTNR1B rs10830962（P=0.800），见图1D，与GDM 风险相关。不同遗传模型和GDM 风险之间关联。见表2。

图1 候选基因多态性与GDM 风险的关联分析

表2 基因型与患GDM 的风险

2.3 识别GDM 的风险因素

为了确定GDM 的危险因素，对流行病学特征进行多变量逻辑回归分析，包括年龄、体质指数、妊娠史、GDM 病史和糖尿病家族史。年龄、有明显较高的体质指数、初产妇、有糖尿病家族史的孕妇、TCF7L2 rs7903146 是GDM 的风险因素。见表3。

表3 基于逻辑回归的GDM 风险多变量分析

3 讨论

在本研究中，分析了目前已报道的流行病学特征和遗传因素与我国妊娠期妇女GDM 的相关性。与以往研究相似的是年龄较大、体质指数、妊娠史、GDM 史和糖尿病家族史是GDM 的危险因素。更重要的是，本研究结果表明TCF7L2 rs7903146 与我国人群的GDM 风险相关，而非CDKAL1 rs7754840、MTNR1B rs10830962 和IGF2BP2 rs1470579 等遗传多态性。

既往研究显示，TCF7L2 属于T 细胞因子/淋巴增强因子家族，通常与β-连环蛋白形成碱性复合物，并在肝脏、胰岛和脂肪组织中调节经典Wnt 信号通路的下游靶基因[12]。TCF7L2 的主要生物学功能是通过影响β 细胞的胰岛素分泌和肝脏糖异生从而调节机体内的糖代谢过程[12]。由于GDM 的主要病理生理学特征是胰岛素抵抗和胰腺β 细胞缺陷，因此，TCF7L2 的功能变异可能对GDM 的发生发展具有重要的影响。

本研究发现只有TCF7L2 rs7903146，而非CDKAL1 rs7754840、MTNR1B rs10830962或IGF2BP2 rs1470579，与GDM 风险相关，该结论与以前研究的系统综述一致[13]。既往研究分析表明，TCF7L2 rs7903146 与GDM 的发病具有显著的关联性[14-15]，该变异体可显著影响TCFL2 的增强子活性从而调节其基因表达[16]。与此同时，已有研究证实GDM和糖尿病之间遗传易感性的相似性。因此，推测rs7903146 T 等位基因抑制了TCF7L2 的表达，从而降低β 细胞的胰岛素分泌，最终导致葡萄糖耐受。当然，本研究发现需要更多的前瞻性临床研究来验证。国外一些研究报道，CDKAL1 rs7754840、MTNR1B rs10830962 和IGF2BP2 rs1470579 与GDM风险相关[17]，而来自国内的研究者则报道称MTHFR rs1801133 的GA 和AA 基因型与太仓地区汉族人群GDM 密切相关，A 等位基因可能增加GDM的风险[18-19]。而在本研究中，CDKAL1 rs7754840、MTNR1B rs10830962 或IGF2BP2 rs1470579 与GDM风险之间未见显著关联。导致上述争议性结论的原因可能是诊断标准、基因型方法、样本量、群体特征和研究设计不同。因此，需要大规模的验证性研究。

本研究发现年龄较大、体质指数、妊娠史、糖尿病家族史等是GDM 的危险因素。来自马来西亚的研究报道称既往GDM 病史的妊娠期妇女发生GDM 风险是无GDM 史的妊娠妇女的8.420倍[20]，而肥胖是GDM 的风险因素[21-22]；此外，部分研究显示糖尿病家族史、年龄≥25 岁、多次妊娠史、糖尿病家族史是GDM 的风险因素[23]，与本研究一致。

综上所述，在我国人群中有妊娠史、较高的体质指数、高龄、糖尿病家族史以及携带的TCF7L2 rs7903146 CT 基因型的妊娠期妇女患GDM 的风险更高，揭示GDM 的发病相关因素，孕早期做到早预防，降低GDM 的发病率，孕中期做到早发现、早治疗，改变可改变因素，如控制体质量增长、调控饮食、适量运动、控制孕前血糖，可有效降低母婴并发症，保障母婴安全。